中国恒河猴（Macaca mulatta）外周血Th17细胞及其在SHIV感染后的变化

【摘要】 　　目的: 对正常中国恒河猴(Macaca mulatta)及嵌合猿猴/人免疫缺陷病毒（SHIV）感染过的中国恒河猴外周血中CD4+IL17A+和CD4-IL17A+T淋巴细胞的分布频率进行初步观察。方法: 用荧光染料标记的单克隆抗体（mAb）对10只中国恒河猴的外周血或PMA+Ionomycin刺激后的PBMC细胞表面的CD3、 CD4、 CD8及细胞内IL17A进行免疫荧光染色。用FACScalibaur获取染色后的样品， 所得数据用CellQuest进行分析。结果: 在6只正常中国恒河猴个体中均能检测到IL17A+淋巴细胞， 未经刺激培养的样品中IL17A+细胞频率很低， 但在短期刺激培养后淋巴细胞中具有约1.4%的淋巴细胞为IL17A+细胞， 明显多于刺激前的IL17A+淋巴细胞; 在短期刺激培养后CD3+CD4+淋巴细胞中大约有2.7%的IL17A+细胞或CD4+Th17细胞。对4只SHIV感染个体中Th17细胞的初步分析未发现它们与正常个体间的统计学差异。结论: 与人类相似， 中国恒河猴的外周血中也存在一定比例的Th17细胞， 为进一步利用恒河猴AIDS动物模型分析HIV/AIDS与Th17细胞的关系提供了基础。

【关键词】 中国恒河猴 外周血单个核细胞 IL 17A+细胞 CD4+Th17 猿猴/人免疫缺陷病毒感染

　　[Abstract] AIM: To observe CD4+IL17+cells in the peripheral blood of Chinese rhesus macaques. METHODS: Peripheral blood samples were collected from normal and SHIV infected rhesus macaques. Surface CD3， CD4， CD8 and intracellular IL17A expression of peripheral blood (with or without PMA+Ionomycin stimulation) were detected by immunostaining with fluorochrome labeled monoclonal antibodies. The samples were acquired with FACScalibur and the data were analyzed with CellQuest. RESULTS: IL17A+cells were observed in all the 6 normal rhesus macaques but there were very few before cultured with PMA+Ionomycin. About 1.4% of lymphocytes were IL17A+cells after stimulation and shortterm cultivation， and about 2.7% of CD3+CD4+ lymphocytes were IL17A+cells， i.e. CD4+ Th17 cells. Th17 cells in the 4 SHIV infected rhesus monkeys were also examined. The number of the Th17 cells detected after stimulation and shortterm cultivation was not significantly different from that of normal monkeys. CONCLUS ION: Similar to human race， Chinese rhesus macaques possess a subset of CD4+IL17A+cells， suggesting these rhesus monkey can be used to study the relationship between Th17 cells and HIV/AIDS.

　　[Keywords]Chinese rhesus macaque; PBMC; IL17A+ cell; CD4+Th17 cell; SHIV infection

　　在对鼠类实验动物的研究中发现， 鼠类动物未接触抗原的CD4+T淋巴细胞在抗原激活后能够分化产生不同表型和功能的辅助性T淋巴细胞。CD4+辅助性T淋巴细胞 (Thelper， Th)因表达不同种类的细胞因子而被人为地分成了多个不同的细胞亚群[1， 2]， 其中研究最多的是Th1和Th3这2个细胞亚群， 前者表达IFNγ和TNFα等细胞因子， 主要与清除细胞内病原体的细胞免疫应答密切相关;　　而后者主要表达IL4、 IL5和IL13等细胞因子， 是清除细胞外病原体的体液免疫应答所必需的辅助性T淋巴细胞。近年来一系列的研究表明CD4+T淋巴细胞中还存在另外一个亚群的辅助性T淋巴细胞， 它们表达白细胞介素17(IL17)， 称为Th17， 是与Th1和Th3都明显不同的淋巴细胞亚群， 主要在诱导自身免疫性组织损伤中发挥作用[1-3]。这些功能正好与CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的功能相反， 后者主要具有抑制自身免疫反应及组织损伤的作用[4]。虽然大多数研究表明Th17主要与自身免疫性疾病和炎性疾病， 如类风湿性关节炎、 哮喘和实验性自身免疫脑脊髓炎等的病理发生密切相关， 但已有研究表明Th17细胞也在感染免疫中具有一定的作用[5]。人体免疫系统具有与小鼠类似的辅助性T淋巴细胞亚群， 包括Th1、 Th3和Th17细胞[6]。Maek等[7]在对40名未经治疗无症状的HIV1感染者外周血Th17细胞的研究中发现HIV1感染者具有较多的Th17细胞， 表明这些细胞可能与艾滋病的病理过程相关， 但具体作用尚不清楚， 需深入研究。恒河猴(Macaca mulatta)是艾滋病研究的首选实验动物之一， 已经在艾滋病病理、 药物和疫苗研究中广泛使用， 可能会在HIV1感染与Th17细胞相互关系的实验研究中发挥作用。虽然已有关于恒河猴血液中细胞因子IL17的报道[8]， 但尚未见关于恒河猴Th17细胞的研究报道。虽然中国恒河猴越来越多地被用于生物医学研究， 且与印度来源的恒河猴对感染和疫苗免疫的免疫应答存在明显差异[9]， 然而对其免疫学背景的研究却远远落后于对印度恒河猴的研究[10]。我们利用流式细胞术（FCM）对正常中国恒河猴的外周血中的Th17细胞及其他IL17分泌细胞进行了分析， 并对4只SHIV感染过的恒河猴中Th17细胞进行了初步观察， 为利用中国恒河猴探讨Th17细胞在HIV/AIDS病理过程中的作用提供基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 静脉血样品分别来自6只正常中国恒河猴和4只SHIV感染过的中国恒河猴（其中2只（Mm#419， Mm#424）在SHIVKB9感染后被SHIVKB9再次感染， 另2只（Mm#427， Mm#428）在SHIVCN97001感染后被SHIVKB9再次感染）。每只动物采集约5 mL外周血液于EDTA抗凝管中并在4 h内运至实验室。利用自动血球计数仪MEK5216K（Nihon Kohden， Japan）对每份样品进行血细胞分类计数。除留下部分全血供表面标志和刺激前胞内IL17 FCM分析外， 其余全血用于PBMC的分离。荧光标记单克隆抗体(mAb)包括CD3PerCP(clone SP342)、 CD4APC(clone L200)、 CD8FITC(clone RPAT8)和四色流式细胞仪FACScalibur均购自BD公司。IL17细胞内染色用mAb为IL17APE购自eBiocience公司。RPMI1640完全培养基购自Hyclone公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PBMC分离与培养 将外周血稀释2倍置于FicollPaque Plus淋巴细胞分层液（Amersham Biosciences， Sweden）上， 离心30 min， 收集淋巴细胞， 用PBS洗2次后悬浮于RPMI1640完全培养液中。对细胞进行计数后将悬浮在含100 mL/L FCS的RPMI1640完全培养液中的细胞密度调节为1×1010/L。在无菌U形底96孔板中加入适量的PI（PMA+Ionomycin）刺激剂， 然后加入50 μL上述准备好的PBMC（5×105/孔）， 于培养箱中37℃、 50 mL/L CO2培养1 h后加入BFA继续培养约10 h。

　　1.2.2 流式染色 染色由表面标志染色和细胞内IL17A染色两部分组成。表面标志染色参照作者以前的方法进行[10]， 主要步骤为: 将100 μL全血加入流式染色管， 然后加入荧光标记抗体CD3、 CD4和CD8室温避光孵育30 min; 用红细胞裂解液裂解红细胞后用A液(10 g/L多聚甲醛)处理10 min， 再用B液(10 g/L皂苷)处理10 min; 加 IL17A抗体避光染色30 min， 洗去多余抗体后上机获取细胞。对经刺激后的PBMC的染色在96孔板上进行， 在CD3、 CD4和CD8染色后直接进行细胞内染色， 随后的步骤与全血中对应步骤相似。

　　1.2.3 FCM检测 样品染色结束后1 h内用四色流式细胞仪FACScalibur获取细胞， 每个样品收集10万个淋巴细胞， 所得数据用CellQuest进行各种细胞亚群大小的分析。

　　1.2.4 统计学分析 对淋巴细胞、 CD3+T淋巴细胞及CD3+CD4+T淋巴细胞中IL17A+细胞所占比例的平均数进行计算， 对感染个体与正常个体间的差异进行方差分析。

　　2 结果
　　
　　使用荧光标记mAb细胞内染色和多色FCM对6只正常和4只SHIV感染中国恒河猴个体外周血中IL17分泌细胞及其表面CD3、 CD4和CD8表达进行比较分析， 发现IL17+细胞不仅分布于CD4+T淋巴细胞亚群中， 也存在于CD4-T淋巴细胞亚群中; 部分IL17+细胞为CD3-淋巴细胞， 有可能是B淋巴细胞或NK细胞（图1）。

　　图1 中国恒河猴外周血中CD3+CD4+IL17A+淋巴细胞的分布（略）

　　Fig 1 Distribution of CD3+CD4+IL17A+cells in the peripheral blood of Chinese rhesus macaques

　　FCM dot plots (from the left to the right) showing CD3+ and CD3- IL17A+ lymphocytes， CD4+ and CD4- IL17+ lymphocytes and CD4+ and CD4-T lymphocytes; first row， cells were unstimualated， second row， cells were stimulated with PMA and Ionomycin.

　　2.1 正常中国恒河猴外周血中IL17A+细胞在各淋巴细胞亚群中的分布频率 在6只正常恒河猴的外周血单个核细胞（PBMC）中IL17A+淋巴细胞的数量很少（表1）。但在用淋巴细胞增殖刺激剂进行短时间刺激培养后， 在每个个体中都能够检测到明显的一个IL17A+细胞亚群（图1下排）。由于刺激前检测出的阳性细胞太少，　　很难对个体间的差异进行可信的比较分析。

　　表1 正常中国恒河猴个体中IL17A分泌细胞的百分比（略）

　　Tab 1 Percentage of IL17A secreting cells in lymphocytes of Chinese rhesus macaques

　　*Indicate the percentage is &<0.00%.

　　经过短期刺激培养后， 在大部分来自正常个体的淋巴细胞中均可检测到约1.4%的细胞为IL17A+细胞; CD3+淋巴细胞中可检测到约2.2%的细胞为IL17A+细胞; CD3+CD4+淋巴细胞中可检测到约2.7%的细胞为IL17A+细胞， 即与人类和小鼠中对应的Th17细胞。这些细胞所占比例在不同个体间及同一个体不同样品间均存在差异。通常IL17A+淋巴细胞中的多数为CD3+细胞， 而IL17A+的CD3+细胞中多数为CD4+细胞。

　　2.2 外周血IL17分泌细胞在SHIV感染个体中的分布 在所有SHIV感染个体的外周血单个核细胞中都能检测到IL17A+细胞（表2）。与正常个体相似， 未经过刺激的PBMC中具有很少的IL17A+细胞， 难于在个体间进行可信的比较分析。

　　表2 SHIV感染个体中IL17A分泌细胞的百分比（略）

　　Tab 2 Percentage of IL17A secreting cells in lymphocytes of SHIV infected Chinese rhesus macaques

　　经过短期刺激培养后， 在大部分来自SHIV感染个体的淋巴细胞中均可检测到约1.5%的细胞为IL17A+细胞; CD3+淋巴细胞中可检测到约2%的细胞为IL17A+细胞; CD3+CD4+细胞中可检测到约3%的细胞为IL17A+细胞。与正常个体相似， 这些细胞所占比例在不同个体间及同一个体不同样品间均存在差异。

　　2.3 SHIV感染对IL17分泌细胞亚群大小的影响 由于未经刺激的PBMC中可检测出的IL17A+细胞数很少， 难以进行可信的定量比较， 因此仅对经短期刺激培养后的IL17A+细胞进行了比较。对短时间刺激后IL17A+细胞比例的比较分析发现SHIV感染个体PBMC中IL17A+淋巴细胞占所有淋巴细胞的比例与未感染的正常个体的无统计学意义(P&>0.05， 图2)。然而2只SHIVCN97001感染个体（Mm#427， Mm#428）在SHIVKB9再次感染后， 其PBMC中IL17A+淋巴细胞的比例略微高于正常个体PBMC中IL17A+淋巴细胞的比例。与之相反， 另2只SHIVKB9感染个体（Mm#419， Mm#424）在SHIVKB9再次感染后， 其PBMC中IL17A+淋巴细胞的比例略微低于正常个体PBMC中IL17A+淋巴细胞的比例。在经SHIVKB9再次感染的SHIVCN97001感染个体与再次感染的SHIVKB9感染个体之间， 在IL17A+淋巴细胞所占比例上具有统计学意义(P&<0.05)。

　　图2 SHIV感染与正常中国恒河猴外周血中IL17A+细胞的比较（略）

　　Fig 2 Comparison of IL17A+ cells between normal and SHIV infected Chinese rhesus monkeys

　　3 讨论
　　
　　IL17最初命名为CTLA8， 1993年首次从鼠cDNA库中克隆出来。许多研究报道中IL17通常指IL17A（我们亦如此采用）， 属于由IL17A、 B、 C、 D、 E、 F组成的IL17家族的一员。已知有多种细胞都能产生IL17， 包括单核细胞、 中性粒细胞、 嗜酸性粒细胞、 Tγδ细胞、 CD8+记忆T细胞和CD4+记忆T细胞。目前普遍认为IL17的主要功能是作为一个前炎性介质在局部诱导IL6， NO和前列腺素E2（PGE2）等放大局部炎症， 在类风湿性关节炎、 移植排斥和系统性红斑狼疮等病理过程中起作用[11]。虽然对鼠和人的IL17及其与疾病的关系有着丰富的研究， 但对广泛用于人类疾病研究的恒河猴中IL17的研究较少[8]， 未见关于中国恒河猴PBMC中IL17分泌细胞的报道。利用细胞内细胞因子染色和FCMS分析， 我们发现中国恒河猴的外周血淋巴细胞中存在约1.4%的IL17A+细胞， 其中多数为CD4+T淋巴细胞， 即Th17细胞。已知在未经刺激的人PBMC中Th17细胞约占CD3+细胞的0.12%， 在刺激后的PBMC中约占CD4+细胞的0.65%。在中国恒河猴中， 未刺激前能检测到的IL17A+细胞较少， 在短期刺激培养后能检测到的IL17A+细胞明显增多， 且较人体中观察到的阳性率高， 可能与各自实验中刺激培养时间不相同等因素有关。
　　　　
　　作为与Th1、 Th3等辅助性T淋巴细胞相对独立的细胞亚群， Th17细胞除在自身免疫性和炎性疾病中起作用外也可能与肿瘤和感染免疫相关[5]。在Helicobacter pylori和Bacteroides fragilis感染中IL17水平明显升高。迄今对Th17细胞在HIV1感染中的作用的研究虽然仅有很少的报道， 但已发现在HIV1感染者中IL17A+细胞存在上升的趋势[7]， 与其他感染中观察到的现象有相似之处。SIV和SHIV感染恒河猴是艾滋病病理、 药物和疫苗等多种研究的首选动物模型， 我们对4只SHIV感染动物PBMC中IL17A+细胞的FCM分析发现与正常个体相比， 感染个体中的Th17细胞亚群大小并无明显变化。但无论在正常个体还是在感染个体之间都观察到了较大的个体差异。由于本次实验中动物较少， 尚需扩大动物数量进行更细致的比较研究。
　　
　　与Th17细胞的功能， 如介导炎性反应和自身免疫疾病相反， 调节性T淋巴细胞（Treg）具有抗炎性反应和维持自身免疫耐受的功能[4]。因此， 二者的动态平衡可能与适当的免疫应答密切相关。中国恒河猴的外周血中具有与人类外周血中相似比例的CD4+CD25+调节性T淋巴细胞[10]， 我们又进一步确定中国恒河猴中具有一定比例的Th17细胞， 为研究这2个细胞亚群在免疫应答过程中的动态平衡及其与人类疾病的关系提供了基础。越来越多的研究表明Treg与Th17都在感染免疫中起作用[12， 13]， 尽管本研究尚不能确定SHIV感染对Th17细胞亚群的影响， 但观察到经SHIVKB9再次感染的SHIVCN97001感染个体比再次感染的SHIVKB9感染个体具有明显较多的IL17A+淋巴细胞， 为进一步的探讨提供了基础。

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