60Coγ射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应

　　　　 作者：刁瑞英， 宋良文， 王少霞， 李明

【摘要】 　　目的: 探讨60Coγ射线照射对肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞的生物效应。方法: 原代分离肺内II型上皮细胞(ATⅡ)和间质细胞包括巨噬细胞和成纤维细胞， 分别进行0、 3、 5、 7 Gy的γ射线照射， 用细胞核嗜银染色观察照射对ATⅡ增殖的影响; 用酶谱分析检测照射后ATⅡ和间质细胞培养上清中基质金属蛋白酶2、 9（MMP2， 9）的活性; 用ELISA检测间质细胞培养上清中TGFβ1和IV型胶原含量。结果: ATⅡ的核仁数量随照射剂量增加而增多， 其中7 Gy组最高; ATII培养上清中MMP2、 9活性随照射剂量增加呈先增高后降低趋势， 间质细胞上清中MMP2、 9活性和TGFβ1水平逐渐升高， IV型胶原分泌水平呈先降低后升高趋势。结论: 放射性肺损伤早期， ATⅡ、 巨噬细胞和成纤维细胞均参与肺组织无效性重建过程， 与晚期肺纤维化启动有一定的内在联系。

【关键词】 肺泡II型上皮细胞 间质细胞 MMPs TGF β1 IV型胶原

　　[Abstract] AIM: To explore the biological effect of 60Coγ ray on alveolar type Ⅱ cells and interstitial cells of alveoliar septum. METHODS: Alveolar type Ⅱ cells（ATⅡ）and interstitial cells including interstitial macrophages and fibroblasts were irradiated by 0， 3， 5， 7 Gy of γ ray respectively. The effect of irradiation on ATⅡ proliferation was observed by argentation against nucleus. The activity of MMP2， 9 in supernatants from ATⅡ and interstitial cells after irradiation was determined by zymography. The levels of TGFβ1 and collagen type IV in supernatant from interstitial cells after irradiation were measured by ELISA. RESULTS: The nucleolus number of ATⅡ was increased with the increase of irradiation dose and group 7 Gy reached the highest level. The activity of MMP2， 9 in supernatant from ATⅡ after irradiation increased at first and then decreased gradually. The activity of MMP2， 9 and the content of TGFβ1 in interstitial cells increased step by step， but collagen type IV decreased at first and then increased. CONCLUSION: ATⅡ， macrophages and fibroblasts are all involved in pulmonary invalid remodeling course in early radiation pulmonary injury， which is related to the initiation of pulmonary fibrosis in late period.

　　[Keywords]alveolar type Ⅱcell; interstitial cell; MMPs; TGFβ1; collagen type IV

　　放射性肺损伤和肺纤维化为临床常见并发症， 其发生机制尚未完全明了， 因此有效防治较为困难[1]。肺损伤早期的形态学改变主要是肺泡基底膜Ⅳ型胶原降解[2]， 继发引起成纤维细胞增生及Ⅳ型胶原再度增多， 常导致肺重建发生。基质中IV型胶原合成和降解平衡失调可能与晚期肺纤维化的启动有关。基质金属蛋白酶2和9(Matrix metalloproteinase2， 9， MMP2， 9)是IV型胶原特异性降解酶。多种细胞参与了肺损伤重建过程， 其中肺泡II型细胞和肺泡隔间质细胞（包括巨噬细胞， alveolar macrophages， AM; 成纤维细胞， fibroblast， Fb）在肺损伤重建和纤维化发生中起重要作用。本研究拟原代分离上述细胞， 探讨60Coγ射线对肺内细胞的生物学效应以及在早期肺损伤重建中的作用， 揭示放射性肺损伤与肺纤维化之间的内在联系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 Wistar大鼠（清洁二级， 180～220 g， 雄性）由军事医学科学院动物中心提供; 新生小牛血清（FCS）购于杭州四季青生物工程研究所; RPMI1640培养基、 DNase、 大鼠IgG、 Triton X100购于Sigma公司; 小鼠抗人Ⅳ型胶原单克隆抗体(mAb)购于北京中杉金桥生物科技有限公司; 兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体购于博士德公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 ATⅡ和间质细胞（AM和Fb）原代分离 参照Dobbs等[3]的方法， 2.5 g/L胰蛋白酶消化和剪碎肺组织， 将细胞悬液加入大鼠IgG包被的培养瓶， 37℃孵育3 h， 贴壁细胞为巨噬细胞和Fb混合体， 将漂浮细胞离心8 min获得ATⅡ。锇酸染色鉴定ATⅡ[4]。

　　1.2.2 细胞处理 将接种ATⅡ的培养瓶随机分为 0、 3、 5、 7 Gy4 组， 每组3瓶， 分别进行γ射线照射， 继续培养48 h后收集上清， 4℃ 3000 r/min离心10 min， 同时制备细胞爬片。间质细胞的处理同上。

　　1.2.3 照射后ATⅡ的增殖分析（嗜银蛋白染色） 爬片入水， 将染液（20 g/L明胶/500 g/L AgNO3为1/2）滴于其上1 h， 封片后图像分析， 在400倍下每组取10个视野， 测定每个视野的颗粒个数及颗粒面积， 求出平均吸光度（A）值。

　　1.2.4 培养上清MMP2、 9活性检测（明胶酶谱） 参照文献[5]， 将ATⅡ和间质细胞上清进行SDSPAGE电泳、 洗脱、 漂洗、 孵育、 染色及脱色， 成像分析条带面积和灰度; MMP2、 9活性＝条带面积×（条带灰度－背景灰度）。

　　1.2.5 间质细胞上清TGFβ1和IV型胶原测定（ELISA） (1)TGFβ1: 上清倍比稀释（1∶40）， 双平行孔， 37℃ 2 h， BSA 37℃封闭2 h， TGFβ1多克隆抗体 (1∶50) 37℃ 30 min， HRP标记的羊抗兔IgG (1∶10000) 37℃ 30 min， TMB 37℃显色15 min， 2 mmol/L硫酸终止反应; 在450 nm处检测吸光度A值; (2)IV型胶原: 同上， 一抗为小鼠抗Ⅳ型胶原mAb（1∶50）， 二抗为HRP标记的羊抗小鼠IgG（1∶10000）。

　　1.2.6 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件进行数据处理， 平均吸光度A值以x±s表示， 组间差异比较采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 ATⅡ分离和鉴定 每只大鼠可分离&>2×107 ATⅡ， 锇酸染色显示胞质内含有嗜锇板层小体， 细胞纯度&>85%。

　　2.2 照射对ATⅡ增殖的影响 照射后ATⅡ内核仁增多， 其中3、 5及7 Gy组的平均A值较0 Gy组分别增加了28.9%（P&<0.05）、 31.3%（P&<0.05） 及95.8%（P&<0.01）， 7 Gy组核仁增多最明显（图1）。

　　图1 照射后ATⅡ核仁的相对含量（嗜银蛋白分析）（略）

　　Fig 1 Nucleolus number of ATⅡ after irradiation (Argentation)

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs 0 Gy group.

　　2.3 细胞上清MMP2、 9活性 (1)在ATⅡ上清中， 3和5 Gy组MMP2活性较0 Gy组分别增加40.3%、 24.8%（P&<0.05）， 7 Gy组较0 Gy组降低6.4%; 3、 5及7 Gy组MMP9活性较0 Gy组分别增加67.5%（P&<0.01）、 30.9%（P&<0.05）和6.4% （图2A）。 (2)在间质细胞上清中， 3、 5和7 Gy组MMP2活性较0 Gy组分别增加45.3%、 89.9%（P&<0.05）和144.8%（P&<0.01）; MMP9活性较0 Gy组分别增加13.4%、 74.0%（P&<0.05）及190.5%（P&<0.01， 图2B）。

　　图2 照后ATⅡ（A）和间质细胞（B）上清MMP2、 9活性(图像分析)（略）

　　Fig 2 Activities of MMP2， 9 in supernatant from ATⅡ(A) and interstitial cells(B) after irraidiation（Image Analysis）

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs 0 Gy group.

　　2.4 间质细胞上清TGFβ1含量 照射后上清中TGFβ1含量出现不同程度的增高， 其中3、 5及7 Gy组较0 Gy组分别增高2%、 5.6%（P&<0.05）及16.4%（P&<0.01）， 5和7 Gy组均具有统计学意义 (图3)。

　　图3 间质细胞上清TGFβ1含量（略）

　　Fig 3 The level of TGFβ1 in supernatant from interstitial cells

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs 0 Gy group.

　　2.5 间质细胞上清IV型胶原含量 上清中IV型胶原含量随照射剂量增加呈先降低后增高趋势， 其中3和5 Gy组较0 Gy组分别降低16.6%和41.1%(P&<0.05)， 而7 Gy组较0和5 Gy组增加了17.9%(P&<0.05)和100% (P&<0.01)， 均具有统计学意义(图4)。

　　图4 间质细胞上清IV型胶原含量变化（略）

　　Fig 4 The level of collagen type IV in supernatant from interstitial cells

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs 0 Gy group.

　　3 讨论
　　
　　肺内AM和Fb胞膜表面含有IgG的Fc段受体， 能与IgG的Fc段结合， 而ATⅡ表面则缺乏Fc段受体。根据这一原理， 本实验采用免疫黏附选择法[3]， 将原代肺组织细胞悬液培养于被覆IgG的平皿中， 有Fc段受体的AM和Fb被黏附贴壁， 而无Fc段受体的ATⅡ得以分离， 可分别获得II型细胞和肺泡壁间质细胞用于放射性肺损伤机制探索。ATⅡ作为肺泡壁重要的结构细胞，能修复受损的肺泡I型上皮， 合成基底膜物质和IV型胶原。ATⅡ向肺泡I型上皮的转化过程是由TGFβ 1通过Smad信号转导途径介导的[6]。ATⅡ的增殖与凋亡在急性肺损伤和放射性肺纤维化的发生中至关重要。有实验表明， 在博来霉素致肺纤维化早期， ATⅡ中MMP2基因转录明显上调[7]。ATII还可产生MMP9[8]， 后者与MMP2共同参与受损肺组织重建过程。ATII在放射性肺损伤中对照射的反应尚不完全清楚， 本实验通过细胞核嗜银蛋白染色分析发现， ATⅡ的核仁随照射剂量增加而增多， 这与对大鼠单侧胸部照射致肺纤维化模型的病理变化相一致[9]， 表明γ射线照射能促进肺泡ATII异常增殖。明胶酶谱分析发现， 小剂量射线照射后， ATII中MMP2、 9的酶活性明显增高， 但随照射剂量增加呈逐渐下降趋势， 甚至低于正常对照水平。提示一定范围剂量的照射能促进ATII异常增生和MMPs的合成， 但剂量偏高时抑制MMP2和MMP9的合成与释放，　　影响对肺泡隔过多IV型胶原的降解作用， 易于启动肺组织重建的发生。目前关于IV型胶原降解对肺纤维化发生的作用仍有争议。有研究认为， 明胶酶降解基底膜IV型胶原容易使ATⅡ与肺泡隔Fb直接接触， 产生细胞间的某种信号转导， 可促进ATⅡ和Fb进一步活化和增殖[10]。有研究报道， Fb产生的HGF和角质细胞生长因子是ATⅡ最有效的有丝分裂原[11]。提示ATⅡ与Fb之间的信息交流（Crosstalking）在肺纤维化启动中可能具有一定作用。
　　
　　TGFβ1可通过调控Fb的细胞周期促进其增殖， 参与放射性肺损伤的发生发展， 该效应可能与Smad通路的活化有关[12]。本实验通过ELISA方法检测AM和Fb培养上清中TGFβ1的含量， 发现TGFβ1水平随照射剂量的增加而升高， 而参与肺重建的IV型胶原水平随照射剂量增加呈先降低后升高趋势; 与此同时， 明胶酶谱分析发现， 随照射剂量增加， 间质细胞合成分泌明胶酶MMP2、 9的活性逐渐增强， 与ATII明显不同。由此可见， γ 射线能刺激AM和Fb分泌TGFβ1和明胶酶， 前者能促进Fb异常增殖， 使肺泡隔增厚， 胶原纤维沉积; 而后者可降解增厚基底膜中的IV型胶原和基质， 有利于Fb在TGFβ1刺激下进一步增生， 继发性分泌TGFβ1、 IV型胶原和明胶酶，　　维持肺组织重建的周而复始的恶性循环过程。实验中见到的间质细胞释放的IV型胶原随照射剂量增加呈先下降后上升趋势可能与ATII在该照射剂量下MMP2和MMP9释放减少和/或此时增生的Fb合成释放的IV型胶原增多有关。
　　
　　上述实验结果提示， 在放射性肺损伤后的肺组织重建过程中， 肺内上皮细胞和间质细胞可能发挥不同的作用， 其中肺泡ATⅡ增生并分泌明胶酶， 降解基底膜内IV型胶原， 导致ATⅡ与Fb直接接触并激活某种信号转导; 而AM通过分泌TGFβ1和明胶酶， 能促进Fb增生和胶原的产生及降解。在整体水平， 由于肺内上皮细胞和间质细胞产生MMPs和MMPs组织抑制因子（Tissue inhibitors of metalloproteinases， TIMPs）的能力不同和时相上的差异[7]， 使肺重建成为无效， 导致细胞外基质中IV型胶原合成和降解平衡失调， 最终启动肺纤维化的发生。

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