人GITRaa27-165蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

　　 作者：仝佳， 王胜军*， 陈君， 毛朝明， 杨云良， 杨敏， 胡正军， 只棣媛， 许化溪

【摘要】 　　目的: 表达和纯化人GITR胞外段（hGITRaa27-165）融合蛋白， 制备hGITRaa27-165融合蛋白的兔源性多克隆抗体(pAb)。方法: 利用PCR从pGEM ThGITR获得hGITRaa27-165编码序列， 将其亚克隆至原核表达载体pQE30， 构建重组表达质粒pQE30hGITRaa27-165; 将阳性重组质粒转化大肠杆菌， IPTG诱导表达融合蛋白， 通过Profinity IMAC NiCharged Resin亲和层析柱进行纯化; 纯化蛋白免疫新西兰大白兔， 获取多克隆抗血清并利用Protein A Sepharose柱进行纯化， ELISA法检测抗体效价， Western blot法检测抗体特异性。结果: 构建了pQE30hGITRaa27-165原核表达载体， 原核蛋白hGITRaa27-165蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达， 通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的hGITRaa27-165蛋白， 蛋白浓度为400 mg/L， 制备的抗hGITRaa27-165多抗效价高达1∶1.6×105， Western blot鉴定其具有良好的特异性。结论: 获得高纯度hGITRaa27-165蛋白， 并制备特异性pAb， 将为进一步研究hGITR的生物学功能提供实验基础。

【关键词】 hGITR 原核表达 多克隆抗体

　　Prokaryotic expression of human GITRaa27-165 and preparation of its polyclonal antibody

　　TONG Jia， WANG Shengjun*， CHEN Jun， MAO Chaoming， YANG Yunliang， YANG Min， HU Zhengjun， ZHI Diyuan， XU Huaxi

　　Department of Immunology and Laboratory Immunology， School of Medical Technology; Department of Ophthalmology， the Affiliated Hospital; Class 3， Grade 2004， Laboratory Medicine of Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China

　　[Abstract] AIM: To express and purify the extracellular region of human glucocorticoidinduced tumor necrosis factor (hGITRaa27-165)， and to prepare and identify the polyclonal antibody (pAb) against this fusion protein. METHODS: The 429 bp DNA sequence of hGITRaa27-165 was obtained from pGEM ThGITR by PCR and then it was inserted into pQE30 plasmid to construct the prokaryotic expression plasmid pQE30hGITRaa27-165. pQE30hGITRaa27-165 was transformed into E.coli. The target fusion protein was expressed with the induction of Isopropyl βD1thiogalacto pyranoside (IPTG) and purified by Ni2+NTA affinity chromatography column. The antiserum against hGITRaa27-165 was obtained from the rabbits immunized with hGITRaa27-165. The titer of pAb was detected by ELISA and the specificity of pAb was identified by Western blot. RESULTS: The prokaryotic expression plasmid pQE30GITRaa27-165 was constructed successfully. The culture condition in which the target fusion protein was highly expressed was found out: the optimal concentration of IPTG was 0.5　　mmol/L， the culture temperature was 30℃ and the culture time was 6 h. The GITRaa27-165 fusion protein was effectively expressed in E.coli as inclusion body. Soluble protein was obtained through denaturation and refolding procedure. The fusion protein was purified by Profinity IMAC NiCharged Resin affinity column with above 90% purity. The antiGITRaa27-165 pAb was prepared by immunizing the rabbits with the purified target fusion protein. ELISA showed the titer of pAb was 1∶1.6×105. Western blot analysis confirmed antiGITRaa27-165 pAb was of good specificity. CONCLUSION: The fusion protein hGITRaa27-165 with high purity has been obtained and the antihGITRaa27-165 pAb with high titer and good specificity has been prepared. Our study may be conductive to further research into the molecular mechanism of action between human GITR and GITRL.

　　[Keywords]human glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor; prokaryotic expression; polyclonal antibody

　　糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor， GITR）是肿瘤坏死因子受体超家族（TNFR superfamily， TNFRSF）的新成员[1]， 高表达于调节性T细胞（Treg）。人类GITR及其配体于1999年分别被克隆成功[2]。初步实验研究中表明， 在正常小鼠体内， GITR信号通路活化后， 可以通过抑制Treg细胞的功能和直接发挥共刺激作用， 促进效应性T细胞的增殖[3， 4]， 进而影响多种免疫进程。然而， 研究中发现人类GITR与小鼠GITR在体内外实验中表现不同[5]， 迄今为止， 有关人GITR分子在免疫系统发育以及在病理生理过程中的作用仍不明了。我们通过工程菌表达人GITRaa27-165重组蛋白， 以Ni2+NTA亲和层析柱纯化蛋白后免疫家兔， 制备相应多克隆抗体（polyclonal antibody， pAb）， 并初步探讨此pAb对人CD4+T细胞增殖能力的影响。为进一步探讨人类GITR分子的生物学功能奠定了基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 聚蔗糖—泛影葡胺液购自上海生工生物工程技术服务有限公司; RPMI1640培养基购自美国Gibco公司; PCR纯化试剂盒、 T4 DNA连接酶购自Promega公司; 高GC BufferI、 LA Taq DNA聚合酶、 dNTP、 限制性核酸内切酶、 DL 2000和λEcoT14I Mr标准Marker均购自TaKaRa公司; IPTG、 PHA购自Sigma公司; 琼脂糖购自上海求德生物化工有限公司; ECL发光底物和Protein A Sepharose购自GE Healthcare公司; 蛋白Mr Marker购自Fermentas公司; Profinity IMAC NiCharged Resin亲和层析柱购自Biorad公司; 抗人GITR单克隆抗体（mAb）购自Biolegend公司; HRP羊抗兔IgG购自北京中山生物技术有限公司; HRP羊抗小鼠IgG购自美国KPL公司; FITC标记羊抗兔IgG购自Zymed公司; 人CD4+T Cell Isolation Kit II购自Miltenyi Biotec公司; pGEM TGITR、 原核表达载体pQE30、 感受态细菌E.coli JM109和E.coli M15由本室保存; 健康雄性新西兰大白兔（体质量2.5～3 kg）， 由江苏大学动物实验中心提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 GITRaa27-165基因的扩增 根据GenBank中人GITR基因（序列号为AY358877）胞外段序列（GITRaa27-165）以及pQE30多克隆位点， 通过Primer Premier 5.0软件设计特异性引物， 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。正义链引物5′端加BamH I酶切位点， 序列为: 5′AA GGATCC CGC CCC ACC GGG GGT C3′， 反义链引物5′端加Hind Ⅲ酶切位点， 序列为: 5′GGG AAGCTT CCA CCC AAG CGG CTC TGC3′。以本室已制备成功pGEM TGITR质粒[6]为模板， 进行PCR， 扩增条件是: 94℃ 5 min预变性， 94℃变性30 s， 66℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 共28个循环。PCR产物在琼脂糖(10 g/L)凝胶上进行电泳， Genius凝胶电泳图像分析系统分析鉴定。

　　1.2.2 GITRaa27165基因表达载体的构建与鉴定 将pQE30载体和上述目的基因的PCR回收纯化产物分别进行BamH I、 Hind Ⅲ双酶切， 37℃过夜。酶切产物在(10 g/L)琼脂糖凝胶上进行电泳， 按照Promega公司胶回收试剂盒步骤要求进行胶回收。将BamH I和Hind Ⅲ双酶切并回收纯化后目的基因GITRaa27-165和载体质粒pQE30， 按5∶1的摩尔浓度比例， 用T4 DNA连接酶连接， 16℃， 过夜[7]。转化感受态E.coli JM109菌， 挑取单个菌落37℃摇菌过夜。提取质粒进行PCR及酶切鉴定， 阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

　　1.2.3 GITRaa27-165蛋白的诱导表达与Western blot鉴定 将鉴定正确的pQE30GITRaa27-165重组质粒转化至工程菌E.coli M15， 挑单个菌落至3 mL LB培养基（含50 mg/L Amp和50 mg/L Kana）中， 37℃摇菌至A600=0.6～0.8。以1∶100的比例将菌液接种于5 mL LB培养基中， 37℃摇菌至A600=0.6～0.8时加入终浓度为0.5、 0.75、 1 mmol/L的 IPTG， 于25℃、 30℃和37℃在 0、 2、 4、 6、 8 h分别进行诱导表达。离心收集菌体后以冷PBS重悬， 直接进行SDSPAGE分析， 考马斯亮蓝R250染色显示蛋白条带。取最高蛋白表达量的菌液1 mL离心， 10000 g， 2 min，　　弃上清液， 以无菌PBS 50 μL重悬沉淀细菌， 超声裂解细菌， 再次离心。分别取上清、 沉淀10 μL行SDSPAGE检测， 以明确目的蛋白在宿主菌中的表达形式。用SDSPAGE胶分离蛋白后， 将分离胶中的蛋白经电转印至PVDF膜上（恒压100V， 4℃， 1.5 h）， 用50 g/L脱脂奶粉封闭电转后PVDF膜， 室温过夜， 按1∶2000的比例， 用50 g/L的脱脂牛奶稀释抗人GITR的mAb， 4℃孵育过夜， 洗涤， 按1∶10000的比例， 用50 g/L的脱脂牛奶稀释HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体， 室温孵育1 h后， 再次TBS/T洗涤， 最后加ECL发光底物， 室温孵育5 min后， 曝光洗片观察结果。

　　1.2.4 GITRaa27-165蛋白的纯化 将已检测证实有GITRaa27-165蛋白表达的菌液300 mL， 8000 g， 4℃离心10 min， 弃上清后， 按（菌重g/缓冲液体积mL） 1∶10比例向沉淀中加入溶菌缓冲液， 重悬细菌， 加入溶菌酶1 g/L， 混匀后冰浴30 min， 冰浴过程中超声裂解细菌（加入蛋白酶抑制剂1 mmol/L PMSF）， 4℃， 10000g离心20min， 弃沉淀， 取上清过Profinity IMAC NiCharged Resin亲和层析柱纯化蛋白。SDSPAGE检测纯化后蛋白纯度， Bradford法测定纯化蛋白的浓度。

　　1.2.5 抗GITRaa27-165 pAb的制备 将弗氏完全佐剂与纯化后GITRaa27-165（400 mg/L）按1∶1的体积比例充分研磨， 制备成油包水乳化剂， 于第1、 7天免疫家兔， 第14、 16、 18天经兔耳静脉注射蛋白原液， 剂量分别为0.1、 0.3、 0.5 mL， 末次免疫后7 d经颈动脉放血， 取血清-70℃保存。

　　1.2.6 抗GITRaa27-165 pAb的纯化和鉴定 以Protein A Sepharose柱纯化抗GITRaa27-165 IgG， 以菌体抗原吸附去除交叉反应性抗体。用纯化后GITRaa27-165融合蛋白包被ELISA反应孔， 以免疫前兔血清作为阴性对照， 纯化后抗GITRaa27-165 pAb倍比稀释后， 通过间接ELISA法检测抗体效价。将纯化后的GITRaa27-165融合蛋白进行SDSPAGE， 以兔源pAb（1∶5000稀释）作为一抗， 以HRP标记山羊抗兔IgG作为二抗进行Western blot检测。

　　2 结果

　　2.1 GITRaa27-165基因扩增结果 以pGEM TGITR质粒为模板， 扩增GITR胞外段序列， 结果条带为429 bp， 与预期大小相符（图1）。

　　图1 GITRaa27-165基因的PCR扩增结果（略）

　　Fig 1 The product of GITRaa27-165 amplified by PCR

　　1: DNA marker DL 2000; 2: GITRaa27-165 gene.

　　2.2 GITRaa27-165基因表达载体的鉴定 将GITRaa27-165亚克隆到原核表达载体pQE30多克隆位点中， 重组克隆经酶切及PCR鉴定， 目的片段大小与预期相符（图2）。测序结果显示目标序列与GenBank（序列号为AY358877）相应序列完全相符（结果未显示）， 证实表达载体构建成功， 命名为pQE30GITRaa27-165。

　　图2 pQE30GITRaa27-165表达质粒的鉴定（略）

　　Fig 2 Identification of expression plasmidpQE30GITRaa27-165

　　1: The product from pQE30GITRaa27-165 amplified by PCR; 2: pQE30GITRaa27-165 digested by BamH I and Hind Ⅲ; 3: pQE30 digested by BamH I and Hind Ⅲ; 4: DNA marker DL 15000.

　　2.3 GITRaa27-165融合蛋白的诱导表达及Western blot 鉴定 pQE30GITRaa27-165阳性菌株经IPTG诱导后收集细菌， SDSPAGE电泳显示: 在30℃、 0.5 mmol/L IPTG诱导6 h条件下， 融合蛋白表达达到高峰， 蛋白条带位于约15600 bp处（与预期相符）， 用抗GITR mAb进行Western blot鉴定， 证实该蛋白条带为GITRaa27-165融合蛋白。该重组蛋白主要以包涵体形式存在， 用Profinity IMAC NiCharged Resin柱进行纯化及复性后， 蛋白浓度为400 mg/L， 纯度扫描证实蛋白纯度在90%以上(图3)。

　　图3 GITRaa27-165融合蛋白在E.coli M15中的表达、 纯化及鉴定（略）

　　Fig 3 Expression， purification and identification of GITRaa27-165 fusion protein in E.coli M15

　　1: pQE30M15 before IPTG induction; 2: pQE30M15 after IPTG induction 6 h; 3: The supernatant of induced pQE30GITRaa27-165M15 after transonogram; 4: The precipitation of induced pQE30 GITRaa27-165M15 after transonogram; 5: Protein marker; 6: Identification of GITRaa27-165 fusion protein by Western blot.

　　2.4 抗GITRaa27-165 pAb的鉴定 家兔在免疫过程中状态良好， 经颈静脉放血获取血清量约20 mL， 经过柱纯化、 交叉吸附处理后获得pAb。根据临界值为阴性对照A值的2.1倍进行判断， 抗GITRaa27-165 pAb的ELISA效价为1∶1.6×105。pAb以1∶5000稀释后进行反应， ECL显色后条带单一， 与PAGE胶考马斯亮兰染色结果， 以及mAb Western blot结果比对， 位置相符（图4）。

　　图4 抗GITRaa27-165 pAb 的Western blot鉴定（略）

　　Fig 4 Identification of antiGITRaa27-165 pAb by Western blot

　　1: GITRaa27-165 fusion protein after purification; 2: Protein marker; 3: Identification of antiGITRaa27-165 pAb by Western blot; 4: The result of Western blot using antiGITR mAb.

　　3 讨论
　　
　　目前GITR被认为是Treg细胞的一种表面标志物[8]， GITR低水平表达在鼠和人类的静息期T细胞上， 经刺激活化后， 表达增高， 同时GITR组成性高表达于Treg细胞膜表面， 经活化后表达进一步上调[9]。 Treg细胞是机体的一种重要调节细胞， 参与了机体的众多生理病理过程， 最近有关Treg细胞的功能研究已经成为免疫领域的一个热点[10]。对于GITR的研究， 主要集中于GITR在GITRL或抗GITR的抗体作用下， 其胞内段活化向T细胞传递信号， 通过对T细胞功能的调控进而调节免疫系统各方面的表现。目前针对小鼠GITR的研究初步认定， GITR信号通路活化后， 可以通过抑制Treg细胞的功能和直接发挥共刺激作用， 促进效应性T细胞的增殖， 同时， GITR分子参与调控细胞凋亡。然而在最近的研究中， 发现尽管在人Treg细胞表面GITR也有高水平表达， 可是当以抗人GITR mAb或以重组人GITRL蛋白触发GITR信号时， Treg的抑制活性并未受到干扰[6]; 此外， Choi的研究团队发现在GITRGITRL相互作用之后， GITR同样可以激活GITRL， 通过GITRL的胞质区传递信号[11]。这些实验现象给我们提出了新的问题， 因此对人类不同亚型T细胞表面GITR分子作用的研究， 将具有更重要的意义， 此外， 当GITR/GITRL这对信号分子相互作用时， 哪一个分子的信号转导途径占有优势的问题也有待解决。
　　
　　为了更深入的探索GITRGITRL信号机制， 本实验中通过构建GITRaa27-165原核表达载体获得GITRaa27-165融合蛋白， 进一步用重组人GITRaa27-165蛋白作为免疫原， 采用经典的免疫方法获得了高效价兔源pAb， 并利用Protein A sepharose柱以及交叉吸附的方法提纯抗体， 排除可能存在的异嗜性抗原的影响。通过 ELISA、 Western blot证实了此pAb效价高、 特异性好。
　　
　　本实验中为深入研究GITR/GITRL的分子间作用机制以及其他可能与GITR相关的分子作用奠定了基础， 并且， 所制备pAb可初步用于检测人体内GITR在各组织器官、 细胞的分布状况， 判断病理情况下（如自身免疫病、 肿瘤、 炎症）的GITR的表达变化， 将对探讨GITR/GITRL、 甚至Treg细胞在发病机制中所起的作用具有重要意义。

参考文献

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