1,25二羟维生素D3对哮喘小鼠气道重塑及基质金属蛋白酶9表达的影响

【摘要】 目的: 观察1，25二羟维生素D3(VD)对哮喘小鼠气道重塑及其肺组织中基质金属蛋白酶9(MMP9)表达的影响，探讨VD在哮喘治疗中的作用。方法: BALB/c小鼠随机分为对照组、 哮喘组及VD组。卵蛋白致敏和激发建立慢性哮喘小鼠模型; HE染色观察各组气道结构改变情况; 采用计算机图像分析系统评价各组气道重塑情况; 采用RTPCR法检测各组的MMP9mRNA表达水平。结果: ①HE染色提示哮喘组与对照组相比出现炎性细胞浸润增多、上皮细胞脱落及平滑肌细胞层增厚等气道重塑改变， 而VD组可部分逆转上述病理改变; ②VD组的支气管内壁厚度、平滑肌层厚度和平滑肌细胞核数显著低于哮喘组， 但仍高于对照组(P&<0.05); ③VD组肺组织MMP9mRNA表达水平均明显低于哮喘组， 但仍高于对照组 (P&<0.05) 。结论: VD干预可明显减轻慢性哮喘气道重塑的病理改变; 并可通过部分抑制肺内MMP9的表达来延缓气道重塑进程。

【关键词】 哮喘 气道重塑 1，25二羟维生素D3 基质金属蛋白酶9

　　近年来气道重建在哮喘发病机制和治疗中的作用受到越来越广泛的关注， 它被认为是哮喘发病机制的一个重要环节和哮喘气道病理改变的重要基础， 同时也是哮喘治疗的一大靶向目标。1，25二羟维生素D3［1，25(OH)2D3］是维生素D的活性代谢产物， 它不仅是体内骨代谢及钙
稳态的关键性调控因子， 同时还是一种第二类固醇激素， 能调节更为广泛的生理作用［1］。但目前国内外尚无其调节哮喘气道重塑的相关研究报道。本试验旨在利用卵白蛋白（ovalbumin， OVA）激发的慢性哮喘小鼠模型， 探讨1，25二羟维生素D3对哮喘气道重构的干预作用， 为其
在哮喘的临床应用提供新的理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　OVA和1，25二羟维生素D3为美国Sigma 公司产品; 氢氧化铝凝胶由上海生物制品研究所提供， TRIzol试剂为美国Invitrogen公司产品; Taq 酶及逆转录RT试剂盒为美国Promega公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验动物分组及哮喘模型的制备

　　4～6周龄健康BALB/c小鼠30只(清洁级， 雄性， 体质量18～22 g)， 由第四军医大学动物实验中心提供。随机将小鼠分为3组: 哮喘组、 VD组及对照组， 每组10 只。哮喘组分别于第0、 7、 14天腹腔注射0.5 mL致敏液(含OVA 10 μg十氢氧化铝凝胶2 mg)进行致敏;从第21天开始为激发阶段， 将小鼠置于自制密闭箱内， 给予雾化吸入25 g/L的OVA溶液30 min， 其中第21天～第27天每日雾化1次， 而后第28天～第77天隔天雾化1次， 共激发8周; VD组以上述同样的方法用OVA进行致敏和激发小鼠， 并在每次激发前1 h分别予以腹腔注射100 ng的 1，25二羟维生素D3; 而对照组则用等量生理盐水代替OVA进行腹腔注射和雾化吸入。末次激发后24 h内处死动物， 取右肺组织用锡铂纸包裹，即刻-70℃冻存，用于总RNA及总蛋白抽提， 左肺经40 g/L多聚甲醛固定后， 石蜡包埋， 切片， 切片厚4 μm， 用于HE染色。

　　1.2.2 肺组织形态学观察及图像分析

　　肺组织切片行HE染色， 400×光镜下观察肺组织病理学改变; 另在200×光镜下， 每只动物切片随机选取5个无软骨且平滑肌成环的完整细支气管横断面(无分叉及断裂)， 且气管最小径/最大径≥0.5， 采用leicaQ500图像分析系统测定支气管基底膜周径(Pbm)、 气管内管壁面积(WAi)， 平滑肌层面积(WAm)、 平滑肌细胞核数(N) ， 并用Pbm将测量值标准化， 分别代表支气管内壁厚
（WAi/Pbm）、 平滑肌层厚度（WAm/Pbm）及平滑肌细胞核数（N/Pbm）， 以衡量气道重塑的程度。

　　1.2.3 RTPCR检测哮喘肺组织MMP9 基因表达
　　采用TRIzol 一步法提取肺组织总RNA， 提取的RNA， 经紫外分光光度计测量A260和A280的值， 判断其纯度， 并由A260吸光度计算出RNA 浓度。按照Promega公司的逆转录试剂盒进行逆转录为cDNA后进行PCR 扩增。MMP9引物为: 上游5′GCCCTACAGCGCCCCCTACT3′， 下游 5′AGACACGCCCCTTGCTGAACA3′， 扩增片段大小为400 bp; 扩增反应参数设置为: 95℃预变性5min; 95℃变性45 s， 57.5℃退火45 s， 72℃延伸1 min， 35个循环; 72℃保温7 min。内参找GAPDH引物为: 上游 5′AACGACCCCTTCATTGAC3′，下游5′TCCACGACATACTCAGCA C3′， 扩增片段大小为191 bp， 扩增反应参数为: 94℃预变性5 min; 94℃变性30 s， 55℃退火30 s， 72℃延伸2 min， 30个循环; 72℃保温7 min。取PCR产物置于20 g/L琼脂糖凝胶中电泳， 溴化乙锭染色， 电泳条带经凝胶成像分析系统扫描
及分析， 并以内参照GAPDH条带进行标化， 计算MMP9PCR产物的相对定量。

　　1.2.4 统计学处理

　　各组实验数据以x±s表示， 采用SPSS10.0软件进行统计学分析。当方差齐性时， 用oneway ANOVA检验组间差异， 用SNKq检验进行两两间比较; 当方差不齐时， 采用KruskalWallis H检验。

　　2 结果

　　2.1 各组激发后哮喘发作情况

　　哮喘多在激发后30 min内发作， 哮喘组小鼠出现口唇发绀、呼吸急促， 腹部翕动， 烦躁不安， 活动频繁等表现， 而VD组发作程度有所减轻， 对照组大鼠行动敏捷， 未见异常。

　　2.2 肺组织病理学改变及图像分析

　　与对照组相比， 哮喘组小鼠气道壁及气道平滑肌明显增厚， 黏膜下水肿， 黏膜下层增宽， 黏膜皱褶增多，管腔狭窄， 有时可见黏液栓堵塞， 气道上皮细胞脱落， 杯状细胞增多， 黏膜下及管周有大量以嗜酸粒细胞为主的炎性细胞浸润（图1）。而1， 25二羟维生素D3的干预部分逆转了上述病变。

　　图像分析结果表明在支气管壁厚度(WA /Pi)、支气管壁平滑肌厚度(平滑肌面积/Pi)、支气管壁平滑肌细胞核数量(N /Pi) 3 个指标上， 哮喘组均显著高于其他各组（表1）， 而VD组上述指标均较哮喘组明显下降， 但仍高于对照组(P&<0.05)。表1 各组小鼠气道形态学指标(略)

　　2.3 肺组织MMP9mRNA的表达

　　RTPCR结果显示， 哮喘组小鼠肺组织MMP9mRNA表达水平明显高于对照组， 而VD组的MMP9mRNA表达水平均较哮喘组显著下降， 但仍高于对照组表达水平（图2）; 对各组条带进行半定量分析示， 对照组、 哮喘组及VD组MMP9 mRNA相对定量分别为(0.57±0.08)、 (5.74±0.13)及（3.16±0.09）， 且两两比较均有统计学意义(P&<0.05)。

　　3 讨论

　　哮喘本质上是一种以Th3细胞免疫应答为主的慢性非特异性气道炎症， 它可引起气道损伤， 随之而来的是气道重建。气道重塑作为哮喘发病机制的一个重要环节， 被认为是哮喘慢性化、持续化、严重化的病理基础， 是哮喘中存在的不可逆性气道阻塞及气道高反应性的病理基
础， 也是激素抵抗性哮喘的病理基础［2， 3］。治疗哮喘必须与防治气道重塑相结合， 只有控制或者逆转了气道重构， 哮喘才可能得到真正意义上的控制。1， 25二羟维生素D3是体内最重要的维生素D的活性代谢产物， 它主要通过与其受体VDR的结合发挥生物学效应。新近研究明确VDR基因是哮喘的易感基因， 提示1， 25二羟维生素D3可能在某种程度上通过与VDR的配体受体效应参与对哮喘的调节作用［4］。目前研究发现1， 25二羟维生素D3在哮喘的免疫应答及慢性气道炎症发面均发挥着复杂的调控作用［5， 6］。本实验在用OVA激发建立慢性哮喘小鼠模型时， 给予腹腔内注射1， 25二羟维生素D3进行干预， 结果显示与哮喘组比较， 1， 25二羟维生素D3不仅减轻了哮喘的急性发作， 而且还部分逆转了哮喘小鼠气道重塑的多种病理改变。进一步应用图像分析软件对各组肺组织进行气道形态学指标的检测， 显示VD组的支气管壁、 平滑肌厚度及细胞核数均较哮喘组明显降低。进一步证实1， 25二羟维生素D3对哮喘气道重塑的改善作用， 同时还提示其对气道平滑肌细胞有明显的抗增生作用。

　　气道重塑过程也是细胞外基质重塑的过程， 上皮下纤维化形成及气道壁Ⅰ、 Ⅲ型胶原的沉积增加是气道重塑的重要病理改变， 在这一过程中MMP9发挥了重要的作用。MMP9是基质金属蛋白酶家族的重要成员， 它与哮喘气道重塑关系密切， 是降解细胞外基质的最主要蛋白酶
。TIMP1是MMP9 的生理性特异性抑制剂， 生理情况下， 它以1∶1 的分子比例与MMP9结合， 特异性抑制MMP9 的活性［7］。有研究表明， 哮喘时， MMP9过度表达， 造成MMP9/ TIMP1失衡， 不仅能导致细胞外基质(ECM) 的降解和沉积发生紊乱， 而且还能诱导嗜酸细胞迁移及影响SMC增殖与迁移， 进而引发哮喘气道重建。因此抑制MMP9表达被认为是改善哮喘气道重塑的重要机制之一［8］。我们用PRPCR法观察1， 25二羟维生素D3对慢性哮喘小鼠肺组织表达MMP9的影响， 结果显示VD组小鼠肺组织中的MMP9 mRNA转录水平较哮喘组明显下降， 说明1， 25二羟维生素D3对哮喘MMP9的表达有良好的抑制作用， 提示1， 25二羟维生素D3可能部分通过下调MMP9表达， 调节MMP9与TIMP1的比例， 来干预哮喘气道重塑， 但尚需进一步研究以证实。

　　目前1， 25二羟维生素D3在临床主要是用于防治哮喘因长期使用激素所致的骨质疏松症， 本研究阐明了1， 25二羟维生素D3在改善哮喘气道重塑中的积极作用， 为扩展其在哮喘防治中的临床应用提供了理论上的可能性。

参考文献

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