系统性红斑狼疮模型小鼠脾脏细胞凋亡及可能机制

　　　　 作者：唐小云， 李霞， 鞠宝玲， 张晓莉， 吕昌龙

【摘要】 　　目的: 研究系统性红斑狼疮（SLE）模型小鼠的脾脏细胞凋亡及其相关调控机制。方法: 采用ConA活化的同系脾脏细胞诱导BALB/c小鼠SLE， 通过检测其外周血自身抗体、 肾组织病理学改变确定SLE小鼠模型诱导成功。脾脏细胞凋亡的检测采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法，免疫细胞化学法检测脾脏细胞Bcl2和NFκB的表达。结果: ConA活化的同系脾脏细胞成功诱导BALB/c小鼠发生SLE， 与盐水对照组和未活化脾脏细胞组比较， SLE模型小鼠脾脏细胞凋亡率明显降低， Bcl2和NFκB的表达均增加（P&<0.01）。结论: SLE模型小鼠脾脏细胞凋亡率降低， 可能是通过Bcl2和NFκB的表达增加所致。

【关键词】 系统性红斑狼疮 细胞凋亡 Bcl 2 NF κB

　　系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus， SLE）患者体内产生多种自身抗体， 核小体是主要的抗原， 核小体通常存在细胞核内， 体内完整的核小体抗原是由细胞凋亡DNA断裂产生的。研究表明， SLE患者存在细胞凋亡紊乱， 细胞凋亡过度[1]或凋亡过低[2]都可导致SLE的发生。机体免疫细胞的凋亡紊乱可能是细胞内凋亡相关基因异常表达的结果， 如Bcl2和NFκB。因此， 本研究采用ConA活化的同系脾脏细胞免疫BALB/c小鼠诱导SLE的发生， 同时检测其脾脏细胞凋亡及Bcl2和NFκB表达的改变以明确细胞凋亡紊乱是否是这一SLE模型小鼠发病的始动因素， 检测凋亡调控因子的改变以揭示SLE发病机制， 为临床治疗SLE提供理论和实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 BALB/c近交系小鼠(雌性， 7～8周龄， 体质量18～22 g， 清洁级)， 购自哈尔滨医科大学附属二院实验动物中心。动物合格证号: SCXK（黑）20020002。刀豆蛋白A(ConA)为Sigma 公司产品。RPMI1640培养基为Gibco公司产品。FITC标记的山羊抗小鼠 IgG 为Santa Cruz公司产品。抗核抗体（antinuclear antibody， ANA）和抗组蛋白抗体（antihistone antibody， AHA）（h3Ah3B）ELISA试剂盒为美国BPB 生物医学有限公司产品。末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling， TUNEL）试剂盒购自美国Promega公司。兔抗Bcl2和小鼠抗NFκB一抗为Santa Cruz公司产品。兔二步法和小鼠二步法检测试剂盒为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 ConA活化的脾脏细胞的制备 无菌取脾脏制备脾脏细胞悬液， 用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640调整脾脏细胞密度为2×109/L， 加入ConA， 使其终浓度为0.005 g/L。然后置37℃、 50 mL/LCO2培养箱内孵育3 d， 收集脾脏细胞悬液，　　并用生理盐水调整脾脏细胞密度为2×1011/L备用。同时制备未添加ConA的脾脏细胞作对照[3]。

　　1.2.2 动物分组及BALB/c小鼠SLE模型的诱导 (1)SLE模型诱导组（MI组）: 取活化的脾脏细胞5×107/只（大约0.2～0.3 mL）分皮下几点注射。每周1次， 连续3次， 第4 周开始进行相应检测。(2)脾脏细胞对照组（CC组）: 给正常小鼠在相同时间、 相同部位注射同等剂量的未经活化的同系脾脏细胞悬液。(3)生理盐水对照（NC组）: 给正常小鼠在相同时间、 相同部位注射相同体积的生理盐水[3]。

　　1.2.3 SLE模型鼠的鉴定 (1)样本收集: 于实验第4周摘除眼球采血析出血清待测，留取肾脏标本进行病理学检测。(2)SLE模型鼠外周血中ANA、 AHA水平的测定: 采用ELISA法检测， 具体步骤按试剂盒说明进行。(3)肾脏病理学检测: 进行光学显微镜、 荧光显微镜和电子显微镜检查。①光学显微镜观察: 常规石蜡切片， HE染色， 用中性树脂封固， 光学显微镜下观察肾脏炎性改变。②荧光显微镜观察: 采用直接免疫荧光法， 简述如下: 取出冻存于-70℃冰箱中的小鼠肾脏， OCT包埋， 5 μm切片， 滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体（1∶100稀释）于组织切片上， 置37℃孵育30 min， PBS液冲洗， 缓冲甘油封片， 在荧光显微镜下观察肾小球内有无IgG沉积及分布部位。③电子显微镜观察: 肾脏经30 g/L戊二醛前固定、 锇酸后固定、 环氧树脂812包埋、 超薄切片、 电子染色后， 透射电镜观察肾小球基底膜、 足突的变化及有无电子致密物沉积。

　　1.2.4 SLE模型鼠脾脏细胞凋亡的检测 于实验第4、 6、 8、 10 周， 无菌取小鼠脾脏， 制备脾脏细胞悬液， 涂片。采用TUNEL试剂盒检测脾脏细胞凋亡， 具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。荧光显微镜下观察并拍照， 采用NISElements BR2.30图像分析系统计数阳性细胞百分率。

　　1.2.5 SLE模型鼠脾脏细胞Bcl2和NFκB的检测 于实验第4、 6、 8、 10 周， 收集脾脏细胞， 涂片固定， 30 mL/L h3O2去除内源性过氧化物酶， 分别滴加1∶200稀释的一抗（兔抗小鼠Bcl2和小鼠抗小鼠NFκB） 50 μL， 4℃过夜， PBS洗涤， 再分别滴加相应的酶标二抗（抗兔和抗小鼠） 1滴， 30℃ 25 min， 洗涤后， DAB显色5～10 min， 苏木素复染， 脱水透明， 中性树胶封片， 显微镜下观察并拍照， 采用图像分析系统计数阳性细胞百分率。
　　
　　1.2.6 统计学处理 应用SPSS11.0统计学分析软件， 单因素方差分析比较各组均值的差异明显。P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 SLE模型鼠的成功建立

　　2.1.1 SLE模型鼠外周血中ANA和AHA水平的变化 MI组BALB/c小鼠自接种活化脾脏细胞后第4 周外周血中出现ANA和AHA， 并随时间浓度逐渐增加， 到第8周达到最高峰， 第10 周有所降低(图1)。

　　图1 SLE模型鼠外周血中ANA、 AHA水平的变化（略）

　　2.1.2 SLE模型鼠肾脏病理的改变 光学显微镜观察MI组小鼠第4周即出现肾小球肾炎， 表现为肾小球体积增大， 系膜细胞增生，肾间质有炎细胞浸润。而CC组和NC组小鼠肾小球结构清晰， 无异常病理改变（图2）。荧光显微镜检查发现MI组小鼠肾脏冰冻切片中大多数肾小球内都有绿色的斑块状沉积物， 可见肾小球毛细血管襻免疫复合物沉积， 呈连续性荧光分布（图3）。而CC组和NC组小鼠肾脏未见IgG类免疫复合物的沉积，直接荧光染色微弱、 无特异性，肾小球轮廓不清（图3）。透射电镜下可见MI组小鼠基底膜区有电子致密物沉积。 CC组和NC组基底膜厚度均匀， 滤过屏障结构完好， 未见电子致密物沉积（图4）。

　　图2 SLE模型鼠肾脏病理形态改变 (HE， ×400)（略）

　　A: NC; B: CC; C: MI.　　　　　　

　　图3 SLE模型小鼠IgG类IC沉积的变化(免疫荧光法， ×400)（略）

　　A: CC; B: NC; C: MI.

　　图4 SLE模型鼠肾脏超微结构的改变（略）

　　A: NC(肾小球足细胞结构完好， 滤过屏障清晰， ×18000); B: CC(基底膜厚度均匀， 滤过屏障结构完好， ×12000); C: MI(免疫复合物沉积在基膜， ×15000).

　　2.2 SLE模型鼠的脾脏细胞凋亡的变化 采用TUNEL试剂盒检测发现正常细胞呈均匀荧光染色， 而凋亡细胞呈致密浓染的颗粒状或块状荧光（图5）。与NC组和CC组（第4、 6、 8和10周分别为1.46±0.24、 1.37±0.34、 1.40±0.23、 1.28±0.19和1.39±0.23、 1.43±0.18、 1.38±0.32、 1.35±0.26）相比较， MI组（第4、 6、 8和10周分别为0.89±0.16、 0.79±0.32、 0.94±0.19、 1.02±0.27）小鼠脾脏细胞凋亡百分率明显降低（P&<0.01）。

　　图5 SLE模型鼠脾脏细胞凋亡的变化（TUNEL， ×400）（略）

　　A: NC; B: CC; C: MI.

　　2.3 SLE模型鼠脾脏细胞Bcl2的表达 免疫细胞化学检测发现Bcl2阳性染色为细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒， 与NC组和CC组（第4、 6、 8、 10周分别为46.92±10.31、 47.87±6.34、 44.32±9.23、 40.94±5.76和41.67±8.43、 45.78±5.64、 40.82±5.86、 44.36±4.87）相比较， MI组小鼠脾脏细胞Bcl2表达细胞的百分率(第4、 6、 8、 10 周分别为89.78±7.62、 92.45±2.89、 80.67±4.87、 75.63±7.83)明显增加（P&<0.01）。

　　2.4 SLE模型鼠脾脏细胞NFκB的表达 免疫细胞化学检测发现NFκB P65阳性染色为细胞质和细胞核中均出现棕黄色或棕褐色颗粒， 与NC组和CC组（第4、 6、 8、 10周分别为31.92±7.53、 28.45±7.42、 34.54±6.43、 31.34±6.85和33.54±6.75、 34.47±5.86、 33.25±7.32、 29.65±4.68）相比较， MI组小鼠脾脏细胞NFκB表达细胞的百分率（第4、 6、 8、 10周分别为52.12±8.87、 59.32±4.76、 50.54±6.78、 47.25±2.87）明显增加（P&<0.01）。

　　3 讨论
　　
　　SLE的主要特点是外周血中出现多种自身抗体以及病变累及肾脏[4]。因此本研究通过检测外周血中自身抗体以及肾脏病理学改变以确定SLE小鼠模型的成功诱导。结果显示， MI组小鼠第4周外周血中出现ANA和AHA， 肾脏出现炎性改变， 肾小球毛细血管襻免疫复合物沉积， 肾脏超微结构改变， 证明MI组小鼠发生了SLE。而两对照组动物外周血中未检出自身抗体， 肾脏也未出现病理改变。
　　
　　越来越多的证据表明， SLE患者淋巴细胞及其亚群的凋亡异常与SLE的发生、 发展密切相关。绝大多数的研究表明SLE患者多种血细胞[5]存在凋亡加速的现象。体内细胞凋亡加速导致核小体释放增加， 致敏自身反应性T细胞并活化B细胞，触发SLE的发生。但凋亡障碍也会导致SLE的发生， 这在SLE动物模型中已经得到证实， 如MRL/lpr[6]和MRL/gld[7]小鼠分别存在Fas、 FasL的单基因突变， 通过这一机制大幅度降低凋亡信号， 从而使自身反应性淋巴细胞逃脱凋亡的命运， 最终导致SLE的发生。在人类也发现1例FasL蛋白减少28个氨基酸， 导致淋巴组织明显增生， 临床上有SLE表现[8]。因此任何形式的凋亡紊乱（凋亡的增加或降低）都可能导致SLE的发生。
　　
　　Bcl2和NFκB是两个重要的凋亡调控因子。Bcl2基因是人们在研究B细胞淋巴瘤中发现的一种异常表达的原癌基因， 其高表达能阻抑多种凋亡诱导因素所引发的细胞凋亡。NFκB是近年发现的转录因子家族中的新成员， 是细胞内最重要的核转录因子， 是细胞激活的标志， 控制众多包括免疫炎症反应、 细胞周期进展、 凋亡抑制和细胞黏附等基因。近年的研究表明NFκB与细胞凋亡的关系密切， 参与多种凋亡相关基因的转录调控。有研究表明NFκB的激活是SLE发生所必须的[9]， 而且发现NFκB抑制物明显减轻MRL/Fas(lpr)小鼠的皮肤病。bcl2启动子上存在NFκB的特异性结合位点， NFκB可通过转录途径直接上调bcl2表达[10]。另外， Bcl2是NFκB所控靶基因表达的激活剂， 它的作用就是能与P50/P56同源二聚体结合， 从而将其从κB结合位点移开， 让异源二聚体有机会结合启动子位点并发挥活性。因此， NFκB作为一种抑制凋亡的转录因子， 通过对Bcl2一类下游抗凋亡基因的调控， 对免疫细胞的正常程序化死亡产生抑制作用， 从而间接促进SLE的发生和发展。
　　
　　总之， 我们在研究中发现免疫同系活化脾脏细胞的小鼠的自身脾脏细胞自发凋亡率明显降低， 这可能是由于体内异常核小体大量增加致敏自身反应性淋巴细胞， 通过NFκB调节凋亡抑制基因Bcl2表达， 抑制淋巴细胞的凋亡。淋巴细胞凋亡过低可能是ConA活化的同系脾脏细胞诱导BALB/c小鼠发生SLE的原因之一。

参考文献

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