Glypican3在多种肿瘤中的表达

【摘要】 目的: 研究Glypican3在多种肿瘤中的表达及意义。方法: 免疫组化方法检测Glypican3在461例多种肿瘤及部分正常组织中的表达。结果: 多种肿瘤中: Glypican3在肝癌中阳性率为74.4%(119/160)， 大肠癌中Glypican3阳性率为66.0%(132/200)， Glypican3在肝癌及大肠癌组织中表达明显高于癌旁组织(P&<0.05); Glypican3在子宫内膜癌（3/16）， 肺癌（3/32）， 乳腺癌（1/15）， 卵巢癌（1/11）， 胰腺癌（0/15）， 食管癌（1/12）等肿瘤中表达较低， Glypican3在癌组织中的表达与癌旁组织无统计学意义。在正常组织如肾， 胎盘， 乳腺当中Glypican3表达为阳性， 其他多种正常组织中表达均为阴性。结论: Glypican3在肝癌、 大肠癌、 肺癌等中均有不同程度表达， 且表达意义不尽相同， Glypican3可能在多种肿瘤发生、 发展中起重要作用。

【关键词】 多种肿瘤 Glypican3 免疫组织化学

Glypican3是一种膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparansulfate proteoglycan， HSPG) ， 通过磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上。Glypican3在细胞的生长发育中起着重要的调控作用， 在不同的恶性肿瘤中表达差异很大［1］。由于该基因的突变导致了细胞增殖、 凋亡失去平衡，
可能是肿瘤发生的重要原因［2］。我国是肿瘤高发地区， 肿瘤的早期诊疗一直是许多学者研究的热点， 探讨肿瘤的发病机制及预警分子将为多种肿瘤的早期诊断及临床治疗提供新的思路。我们利用Glypican3多克隆抗体进行免疫组化检测Glypican3基因在多种肿瘤组织中及部分正常组织芯片中的表达， 以探讨其与多种肿瘤发生发展的关系。

　　1 材料和方法

　　1．1 材料

　　兔抗Glypican3多克隆抗体购自R&&D公司。SP试剂盒购于GENE TECH公司。正常组织芯片购自超英公司。标本来源多种肿瘤为西京医院2004/2007年外科手术切除标本。选自术前的肿瘤组织， 经40 g/L甲醛固定， 脱水， 常规石蜡包埋， 制备5 μm厚连续切片。经病理确诊。癌旁组织选自多种肿瘤两端切缘， 并经病理证实无癌细胞浸润。患者中肝癌160例， 大肠癌200例， 子宫内膜癌16例， 肺癌32
例， 乳腺癌15例， 卵巢癌11例， 食管癌12例， 胰腺癌15例， 男性238例， 女性223例; 年龄≤50岁者266例， ＞50岁者195例; 同时选购部分正常组织芯片。

　　1．2 方法

　　1．2．1 Glypican3病理表达的检测

　　操作按SP试剂盒说明书进行， 采用常规SP法检测［3］。石蜡切片常规脱蜡至水， 清洗3次; 30 mL/L的h3O2甲醇室温下45 min以阻断内源性过氧化酶， 清洗3次; 修复抗原: 0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液中， 煮沸3次， 自然冷却至室温， 清洗3次， 正常羊血清封闭45 min， 清洗3次; 加入兔抗人Glypican3多克隆抗体4℃过夜; 复温， 清洗3次， 加辣根过氧化物（HRP）标记的羊抗兔IgG（工作浓度1∶500）， 37℃于湿盒中45 min， 清洗3次， DAB显色， 蒸馏水中止， 苏木精衬染， 自来水反蓝， 梯度酒精及二甲苯脱水透明， 树胶封片。以癌旁肝组织作阴性对照， 以IgG代替一抗作空白对照［4］。

　　1．2．2 结果判定

　　由两位病理医师在不知任何临床和病理资料的情况下对免疫组化结果进行评估。镜下， 随机取5个视野， 根据每个视野中阳性细胞数百分比和染色强弱进行评分［5］。镜下观察肿瘤实质细胞着色广度: 0分， 阳性细胞数比率&<1%; 1分， 阳性细胞数比率2%～25%; 2分， 阳性细胞数比率26%～50%; 3分， 阳性细胞数比率51%～75%; 4分， 阳性细胞数比率＞75%。着色强度: 0分， 细胞无着色; 1分， 阳性细胞数染色呈淡棕色; 2分， 阳性细胞染色呈棕色; 3分， 阳性细胞染色呈棕褐色。然后判定各标本的染色得分。着色总分（0～12）=广度×强度; 总分分级: 0～3分视为0级， 为阴性表达， 4～6分视为Ⅰ级， 7～9分视为Ⅱ级， 10～12分视为Ⅲ级。0级为阴性， Ⅰ～Ⅲ级为阳性表达［5］。

　　1．2．3 统计学处理

　　采用χ2检验， 选用SPSS10.0统计软件进行数据分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2．1 Glypican3在多种肿瘤及部分正常组织芯片中的表达

　　Glypican3主要表达于癌细胞的细胞胞质、 胞膜; 阳性细胞以弥漫型分布为主(表1)。Glypican3在461例多种肿瘤及部分正常组织中的表达显示: 多种肿瘤中肝癌中阳性率为74.4%(119/160)， 大肠癌中Glypican3阳
性率为66.0%(132/200)， Glypican3在肝癌及大肠癌组织中表达明显高于癌旁组织(P&<0.05)。Glypican3在子宫内膜癌（3/16）， 肺癌（3/32）， 乳腺癌（1/15）， 卵巢癌（1/11）， 胰腺癌（1/15）， 食管癌（1/12）等肿瘤中表达较低， Glypican3在这些癌组织中
的表达与癌旁组织无统计学意义。在正常组织如肾， 胎盘， 乳腺当中Glypican3表达为阳性， 其他多种正常组织中表达均为阴性(图1， 表2)。表1 多种肿瘤中Glypican3的表达（略）表2 多种正常组织芯片中Glypican3表达（略）

　　3 讨论

　　Glypican3基因组结构全长&>900 kb， 是人类基因组中最大的基因之一， 是通过磷脂酰肌醇锚定于细胞膜表面脂质的硫酸类肝素蛋白聚糖， 参与调节胚胎生长发育［6］。Glypican3可结合肝素结合型蛋白如生长因子、 细胞细胞黏附分子， 调控细胞生长增殖等行为， 在机体的生长发育中起着重要的作用。Glypican3的表达缺失导致了机体过度生长疾病（SGB）［1］。由于Glypican3的突变导致了细胞增殖和凋亡失去平衡， 可能是肿瘤发生的重要原因。Pilia等［1］应用Northern blot检测到胚胎期Glypican3表达于发育中的小肠， 中胚层来源组织中， 而成人除在胎盘、 乳腺、 间皮、 卵巢、 肺及肾组织有弱表达之外， 其他正常分化组织中目前尚未发现有表达。有研究［7］表明Glypican3与多种肿瘤关系密切， 包括肝癌、 大肠癌， 恶性黑色素瘤、 成神经细胞瘤、 乳腺癌、 卵巢癌等， 且在不同的肿瘤中Glypican3可能发挥不同的作用， 甚至可能起完全相反的作用， 提示Glypican3是一个值得期待的多种肿瘤特异性标志物， 其具体作用机制需要进一步研究。Kwack等［7］认为Glypican3抑制FGF2介导细胞增殖， 降低HCC细胞与胶原I型及纤维连接蛋白之间的黏着力， 增强细胞迁移侵袭能力。Grozdanov等［8］研究发现Glypican3在胚胎肝细胞中高表达， 在活化的肝祖细胞中表达， 但在出生后3周的肝细胞中未见表达， 由此认为Glypican3可作为肝祖细胞和早期肝损伤的一个标志。且Glypican3能增强Wnt活性， 同过调节正规Wnt 信号通路刺激肝癌细胞的增殖。
　　
　　本研究通过石蜡切片， 组织芯片的免疫组化方法检测多种癌及部分正常组织中Glypican3表达情况， 检测Glypican3表达在不同部位相同和不同组织学类型癌发生发展中可能的作用。结论表明Glypican3在肝癌， 大肠癌等表达上调， Glypican3高表达可能与肿瘤细胞的生长及分化能力相关。Glypican3在这些肿瘤对应的正常组织中肝脏， 大肠组织Glypican3表达阴性， 而在部分有Glypican3弱表达的正常组织如卵巢， 乳腺， 肺， 间皮所对应的肿瘤组织如: 卵巢癌， 乳腺癌， 肺腺癌等中表达下调。其中在乳腺组织中的表达高于在乳腺癌中的表达。这些结论与国外文献报道［7， 9］基本一致， 表明Glypican3在这些肿瘤中的作用复杂， 起着促进、 抑制或是中立的作用， 其中
具体作用机制需要进一步研究。

　　为何在不同组织及肿瘤中Glypican3的调控作用如此不同， 是下一步研究的一个方向。与以往结论不同的是本次研究Glypican3表达上调阳性率最高的肝癌中， 我们发现部分癌旁肝硬化组织Glypican3阳性表达明显高于癌旁正常组织， 有少数癌旁肝硬化组织表达阳性， 提示了Glypican3具有某种预警价值， Hippo等［10］认为Glypican3可作为肝癌的血清学诊断标志之一， Glypican3是否在肝硬化发展为肝癌中起到了某种调控作用， 还需要深入研究探讨。Glypican3在多种肿瘤发生发展中起到怎样的调控作用， 与哪些分子有关， 能否做为一个肿瘤的治疗靶点， 有待进一步研究。

参考文献

　　［1］Pilia G， HughesBenzie RM， MacKenzie A， et al. Mutations in GPC3， a glypican gene， cause the SimpsonGolabi　Behmel overgrowth syndrome［J］. Nature Genet， 1996， 12（3）: 241-247.

　　［2］Yamauchi N， Watanabe A， Hishinuman M， et al. The glypican3 oncofetal protein is a promising diagnostic marker for hepetocellular carcinoma［J］. Mod Pathol， 2005， 18(12): 1591-1598.

　　［3］Hsu HC， Cheng W， Lai PL. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution［J］. Cancer Res， 1997， 57(22): 5179-5184.

　　［4］孟存英， 袁东红， 刘 杰， 等. 人核糖体蛋白S15a在胃腺癌中的表达［J］. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(10): 937-938.

　　［5］ 陈凯歌， 谢华红， 刘 杰， 等. 乙型肝炎病毒X蛋白与缺氧诱导因子1α在肝癌中的表达及可能的调节机制［J］. 中华肝脏病杂志， 2007， 15（2）: 122-125.

　　［6］Song HH， Shi W， Xiang YY， et al. The loss of Glypican3 induces alterations in Wnt signaling［J］. J Biol Chem， 2005， 280(3): 2116-2125.

　　［7］Kwack MH， Choi BY， Sung YK. Cellular changes resulting from forced exp ression of glypican23 in hepatocellular carcinoma cells［J］. Histol Histopathol Mol Cells， 2006， 21(2): 224-228.

　　［8］Gonzalez AD， Kaya M， Shi W， et al. oci/Glypican3， a glypican encoded by a gene that is mutated in the SimpsonGolabiBehmel overgrowth syndrome， induces apoptosis ina cell linespecific manner［J］. J Cell Biol， 1998， 141(6): 1407-1414.

　　［9］Peters MG， Farias E， Colombo L， et al. Inhibition of invasionand metastasis by Glypican3 in a syngeneic breastcancer model ［J］. Breast Cancer Res Treat， 2003， 80(2): 221-232.