虾类和蟹类的过敏原组分分析

　　　　 作者：毛露甜， 范红英， 张在军， 黄婉慧， 杨华胜， 周立斌

【摘要】 　　目的: 分析虾类和蟹类的过敏原组分。方法: 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）和Western blot分析虾类和蟹类的主要过敏原组分。结果: 不同种类的虾其主要过敏原组分相对分子质量(Mr)在36 000附近， 不同种类的蟹主要过敏原组分Mr在29 000、 36 000、 66 000、 89 000附近。结论: 不同种类的虾蟹存在共同过敏原。

【关键词】 虾 蟹 过敏原 免疫印迹

　　过敏症是一类常见变态反应性疾病， 近年来其发病率明显上升。食物过敏原已成为食品安全隐患之一［1］， 食物过敏是急需研究的新课题［2］。我国对食物过敏的研究和关注与国外发达国家相比有较大差距， 但随着经济的发展和人民生活水平的提高， 人们对过敏症的关注和重视大为提高。虾蟹等水产品是常见的过敏性食物［3］， 在我国尤其沿海地区常见食用虾蟹引起过敏的报道［4］。有资料显示， 河虾的过敏率高达39.0%， 远高于其他种类的食物过敏［5］。近年来， 美国食品药品管理局（FDA）和欧洲食品安全局（EFSA）都针对食品中的过敏原成分制定了相应的法规［6， 7］。本研究中， 我们分析了虾类和蟹类的过敏原组分， 对保障人们食品安全、提高生活质量有着积极的意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 HRP标记羊抗人IgG购自鼎国生物公司; HRP标记羊抗人IgE购自Serotech公司; 牛血清白蛋白购自Sigma公司; 蛋白质相对分子质量(Mr)标准购自TaKaRa公司; PVDF膜购自美国Osmonics公司; 96孔酶标板购自Biomat公司; MINI PROTEAN11TM垂直板电泳仪和转移系统购自BIORAD公司; 全自动酶标仪购自Thermo 公司， TGL16G冷冻离心机、 S53型紫外可见光分光光度计、 DYB2型脱色摇床均为上海三科公司的产品。虾类（刀额新对虾、 日本沼虾、 口虾蛄）和蟹类（中华绒螯蟹、 梭子蟹、 青蟹）购自惠州市西湖市场， 均为活品。从惠州市中心人民医院检验科收集20例虾、 蟹过敏患者的阳性血清， 等量混合组成标准血清， 采无过敏症的健康人血清作阴性血清。分离血清并分装后于-20℃冻存备用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 虾、 蟹过敏原浸液的制备及SDSPAGE分析 参照文献［8］的方法略作修改， 取其肉用组织搅拌机捣碎后用预冷的丙酮去脂3次至脱脂完全为止， 待丙酮完全挥发后， 以0.01 mol/L PBS为提取液按1∶20加入虾/蟹的丙酮粉， 置4℃冰箱冷浸过夜以提取过敏原蛋白。以12 000 r/min转速冷冻离心20 min， 用考马斯亮蓝法进行蛋白定量后， 过滤除菌， 分装， -20℃保存备用。将待分析的过敏原与上样缓冲液等体积混合， 煮沸3～5 min使蛋白变性， 取适量样品上样， 以溴酚蓝指示， 考马斯亮蓝R250染色后脱色至背景为无色为止。

　　1.2.2 Western blot 分析虾、 蟹的过敏原组分 参照文献［9］的方法， 各种虾蟹的蛋白经SDSPAGE分离后， 湿印迹至PVDF膜， 30 g/L BSA 4℃封闭过夜， 与相应过敏症患者的阳性血清（1∶20）反应， 用无过敏症的健康人血清设阴性对照。4℃孵育过夜， 洗涤后加入羊抗人IgEHRP（1∶300）二抗， 37℃孵育2 h， 用底物DAB显色， 显色条带与预染的Mr标准对照， 确定其Mr。

　　2 结果

　　2.1 SDSPAGE分析虾类的蛋白组分 刀额新对虾、 日本沼虾和口虾蛄的蛋白浸液经SDSPAGE分析见图1，结果显示， 刀额新对虾可辩条带14条， 组分Mr分布在15 000～97 000之间， 其中主条带有7条， Mr分别为21 000、 36 000、 38 000、 40 000、 48 000、 66800和74 700。日本沼虾可辩条带11条， Mr分布在14 000～97 000之间， 其中主条带有9条， Mr分别为21 000、 25 000、 29 000、 32 000、 36 000、 44 000、 52 000、 66 800、 74 700。口虾蛄可辩条带12条， Mr分布在14 000～97 000之间， 其中主条带有9条， Mr分别为15 000、 20 000、 23 000、 36 000、 38 000、 40 000、 48 000、 66 800、 89 000。

　　图1 不同虾类蛋白浸液的SDSPAGE分析（略）

　　1: 蛋白marker; 2: 刀额新对虾; 3: 日本沼虾; 4: 口虾蛄.

　　2.2 SDSPAGE分析蟹类的蛋白组分 中华绒螯蟹、 青蟹和梭子蟹的蛋白浸液经SDSPAGE分析， 结果如图2所示， 中华绒螯蟹可辩条带11条， 条带Mr分布在20 000～90 000之间， 其中主条带有7条， Mr分别为20 100、 29 000、 33 000、 35 000、 38 000、 49 000、 66 400。青蟹可辩条带13条， 条带Mr分布在14 000～90 000之间， 其中主条带有9条， Mr分别为14 300、 20 100、 27 000、 29 000、 35 000、 38 000、 44 300、 66 800、 89 000。梭子蟹可辩条带17条， 条带Mr分布在15 000～90 000之间， 其中主条带有10条， Mr分别为15 000、 19 900、 22 000、 27 000、 29 000、 38 000、 44 300、 49 000、 66 800、 89 000。

　　图2 不同蟹类蛋白浸液的SDSPAGE分析（略）

　　1: 蛋白marker; 2: 中华绒螯蟹; 3: 青蟹; 4: 梭子蟹.

　　2.3 Western blot分析虾类的过敏原 3种虾的粗提液经Western blot分析， 结果见图3。刀额新对虾、 日本沼虾和口虾蛄3种浸液中的36 000的蛋白组分均可与虾过敏患者的血清IgG和IgE结合， 说明3种虾的主要过敏原均为36 000的蛋白组分。3种虾的印迹膜与阴性血清反应均未显条带。

　　2.4 Western blot分析蟹类的过敏原 3种蟹的粗提液经Western blot分析， 结果见图4。中华绒螯蟹的印迹膜可与蟹过敏患者的阳性血清IgG和IgE结合， 主要过敏原Mr为66 000的组分; 青蟹蛋白组分中可促使机体产生IgG的蛋白质Mr分别为36 000、 89 000， 而促使IgE产生的蛋白质Mr分别为27 000、 36 000、 89 000; 梭子蟹印迹膜与蟹过敏阳性血清IgE结合的蛋白质Mr分别为36 000和89 000的组分， 而与IgG结合的蛋白质Mr分别为29 000和89 000。3种蟹的印迹膜与阴性血清反应均未见条带。

　　图3 Western blot分析虾类的过敏原组分（略）

　　M: 蛋白marker; 1-3: 分别为刀额新对虾、 日本沼虾和口虾蛄的SDSPAGE图谱; 1a-3a: 分别为刀额新对虾、 日本沼虾和口虾蛄与IgE结合的条带; 1b-3b: 分别为刀额新对虾、 日本沼虾和口虾蛄与IgG结合的条带; 4， 5: 阴性对照试验.

　　图4 Western blot分析蟹类的过敏原组分（略）

　　M: 蛋白marker; 1-3: 分别为中华绒螯蟹、 青蟹和梭子蟹的SDSPAGE图谱; 1a-3a: 分别为中华绒螯蟹、 青蟹和梭子蟹与IgE结合的条带; 1b-3b: 分别为中华绒螯蟹、 青蟹和梭子蟹与IgG结合的条带; 4， 5: 阴性对照试验.

　　3 讨论
　　
　　虾的蛋白质组成均存在一定差异， 在Mr为36 000附近， 本研究中的这3种虾均出现了明显条带， 这与李振兴等［10］报道的结果基本一致， 部分结果有差异可能是虾蟹和人的种属差异引起的。Mr 36 000的组分也是国外报道的最可能引起过敏的虾类过敏原——原肌球蛋白， 超过84％的虾过敏症患者血清能与其发生作用。本研究结果显示， 即使属于不同的目（十足目和口足目）， 虾的主要过敏原没有明显变化， 这与原肌球蛋白在肌原纤维中最稳定的特性相吻合。
　　
　　本实验中分析的3种蟹都为十足目但属于不同科， 其过敏原Mr分布在29 000～89 000之间， 主要过敏原Mr为36 000和89 000的蛋白组分。可见虾与蟹作为甲壳类水产品具有共同的过敏原， 这与Martinez等［11］报道的原肌球蛋白是无脊椎动物的主要过敏原并且相互之间存在严重交叉反应的结论相吻合。

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