【摘要】 目的: 铝胶苗和蜂胶佐剂苗对E.coli免疫原性的比较。方法: 选用菌株O2、 O78及O157菌株血
清型， 研制的多价大肠杆菌氢氧化铝胶和蜂胶佐剂灭活苗， 对同血清型菌株的攻击具有良好的保护作用。结果: 通过用铝胶苗和蜂胶佐剂苗试验结果表明， 对于大肠杆菌病而言， 用蜂胶佐剂苗的效果优于铝胶苗。结论: 蜂胶佐剂苗的效果优于铝胶苗。
【关键词】 铝胶佐剂苗; 蜂胶佐剂苗 E.coli 灭活苗
免疫佐剂可增强抗原所激发的抗体应答， 可提高免疫原性， 以及增强吞噬细胞的非特异性杀伤功能和特异性细胞免疫的刺激作用等。因此，佐剂是疫苗特别是灭活疫苗所必不可少的成分。蜂胶作为一种具有生物活性的免疫佐剂所显示出的优点已逐渐被认识［1］。蜂胶具有广谱生物学活性， 是一种良好的免疫增强剂和刺激剂［2］， 它既能引起特异性免疫应答， 又能启动非特异性防御机制， 有增强免疫抗体生成和提高白细
胞吞噬能力的明显效果［3］。
1 材料和方法
1.1 材料
致病性大肠杆菌O2、 O78由华西医学院提供。O157菌株由本医学院实验室保存。改良沙氏培养基、 厌氧肉肝汤、 三氯化铝、 氢氧化钠、 甲醛、 9 g/L氯化钠、 蜂胶等购自大连宝生物工程有限公司。小白鼠(质量18～22 g， 60只， 雌雄各半)由本医学院动物实验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 小白鼠致死性试验
致病性大肠杆菌O2、 O78及O157分别接种到伊红美蓝培养液上， 37℃培养18～24 h。取单菌落接种到5 mL肉汤中， 37℃、 200 r/min过夜。分别接种质量18～22 g小白鼠5只， 每只腹腔注射0.5 mL菌液， 并设注射同批无菌肉汤培养液的5只小白鼠作对照， 隔离饲养， 观察小白鼠发病和死亡情况。
1.2.2 菌苗液培养及纯粹检验
将致病性大肠杆菌O2、 O78及O157分别接种于牛肉汤内， 37℃培养备用。将上述3种培养液等量混合， 按1％的
量接种肉汤的锥型瓶内， 37℃培养24 h， 其间摇8次/2 min， 此时大肠杆菌含量最高， 及时计数及灭活。取培养好的菌液， 作检验， 每瓶样品需用改良沙氏培养基， 马丁肉汤琼脂斜面管2支， 每支接种扩大培养液0.2 mL; 另用50 mL的厌气肉肝汤和马丁肉汤各1瓶， 分别接种扩大培养液0.5～1 mL。37℃培养7 d， 观察细菌生长情况。
1.2.3 活菌计数、甲醛灭活及无菌检验
取菌液1 mL， 按常规稀释法将菌液连续10倍稀释， 取10-9、 10-10 两个稀释度用1 mL无菌吸管取2个稀释度的菌液1 mL， 接种于普通琼脂培养基中， 37℃培养24 h， 次日数菌。按菌液总量的0.4％加入甲醛溶液（按含甲醛40％折算加入）， 摇匀后， 于37℃摇振培养杀菌2～4 d。取灭活好的菌液， 接种于营养琼脂培养基和血琼脂培养基上， 同时接种厌气肉肝汤， 37℃培养3～5 d， 观察有无细菌生长。若未见细菌生长则判为合格。检验合格后4℃保存， 待配疫苗。
1.2.4 佐剂和疫苗的制备
(1)氢氧化铝胶的制备: 取25 g无水AlCl3配成250 mL/L溶液， 使用时将其稀释成80 mL/L。另将NaOH配成40 mL/L溶液。将AlCl3溶液与Al(OH)3溶液混合高压灭菌， pH5.5。(2)蜂胶的制备: 取蜂胶磨碎， 溶解于950 mL/L的分析纯乙醇中形成过饱和的蜂胶乙醇溶液作为制苗的佐剂， 2 h摇动1次， 2 min/次。(3)氢氧化铝胶佐剂灭活苗的制备 按菌液5∶1的比例加入灭菌处理过的氢氧化铝胶和0.1 g/L的硫柳汞， 静置3～4 d， 4℃保存。(4)蜂胶佐剂灭活苗的制备: 100 mL灭活菌液中加入3 mL蜂胶提纯液， 充分摇匀后4℃保存。
1.2.5 无菌、安全性及稳定性检验
取灭活好的菌液， 37℃培养3 d， 观察有无细菌生长。取15只18～22 g小白鼠， 随机分成3组， 一组为对
照组， 试验组分别接种2种疫苗， 每只腹腔注射0.5 mL， 对照组腹腔注射0.5 mL生理盐水。观察1周， 记录临床症状和注射部位病变， 并于试验期末活检受试鼠， 观察疫苗吸收状况。将疫苗置于4℃保存1个月， 观察性状有无变化。
1.2.6 小白鼠最小免疫剂量的测定
质量为18～22 g的小白鼠50只分成2批， 每批25只小白鼠， 每批分为5组， 每组5只， 每批分别腹腔注射氢
氧化铝胶灭活疫苗和蜂胶灭活疫苗0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5 mL; 同时设对照5只， 注射生理盐水。10 d后用E.coli O2、 O78及O157混合菌液攻击， 每只小鼠腹腔注射菌液0.5 mL（5～8×1010CFU/L）， 观察并记录小白鼠发病状况， 测定其保护率(表1)。表1 小白鼠最小免疫剂量的测定试验结果（略）
1.2.7 效力检验
质量为18～22 g的小白鼠50只分成2批， 每批 25只小白鼠， 每批分为5组， 每组5只， 每批分别腹腔注射蜂胶灭活疫苗和氢氧化铝胶灭活疫苗0.3 mL和0.5 mL， 同时设对照5只， 注射生理盐水接种后于第10天连同对照组用E.coli O2、 O78及O157混合菌液攻击， 每只小
鼠腹腔注射菌液0.5 mL（5～8×1010CFU/L）， 观察1周， 对发病与死亡小鼠剖检和检菌。求出疫苗的疫苗保护率=保护数/攻毒数×100%（表2）
。
2 结果
2.1 菌种毒力鉴定及活菌计数
腹腔注射菌液的小白鼠在1 d内全部死亡， 解剖症状为急性败血性病变， 说明所选用菌株为强毒株， 致病性强
。取菌液1 mL， 按常规稀释法将菌液连续10倍稀释， 取10-9、 10-10两个稀释度用1 mL无菌吸管取两个稀释度的菌液1 mL， 接种于普通琼脂培养基中， 37℃培养24 h， 次日数菌， 每毫升含大肠杆菌1010。
2.2 甲醛灭活效果鉴定
取灭活好的菌液， 接种于营养琼脂培养基和血琼脂培养基上， 同时接种厌气肉肝汤， 37℃培养3～5 d， 均无细菌生长。灭活合格。
2.3 灭活苗无菌检验、安全性及稳定性检验
每瓶灭活疫苗取样0.5 mL， 接种于营养琼脂平板， 37℃培养1周， 均无细菌生长。检验合格， 试验组和对照组全部健活; 4℃放置1个月， 疫苗无发生性状变化。
小白鼠注射0.3 mL的蜂胶疫苗后， 再注射5～8×1010CFU/L的大肠杆菌， 小白鼠能够得到完全保护; 给小白鼠注射0.5 mL的氢氧化铝胶疫苗后， 再注射5～8×1010CFU/L的大肠杆菌， 能够得到完全保护。故， 蜂胶疫苗和氢氧化铝胶疫苗对小白鼠的最小免疫剂量分别为0.3 mL和0.5 mL。
2.4 效力检验结果
小白鼠注射0.3 mL的蜂胶苗后， 免疫第10天再以O2、 O78及O157的混合菌液攻毒， 能够产生100%的保护; 注射0.5 mL氢氧化铝胶苗， 能够产生88%的保护(表2)。表2 为效力检验结果（略）
3 讨论
蜂胶做为佐剂制备灭活疫苗国内早已有人报道。蜂胶能全面启动机体的免疫防卫系统， 刺激机体细胞免疫、 体液免疫、 红细胞免疫系统和巨噬细胞补体系统都能产生免疫应答［4］。资源丰富、 价格低廉、 安全无毒、 便于吸收等优点。蜂胶还具有抑菌、 杀菌作用， 已被应用于人类的保健食品和治疗性药物［5］。
选用菌株O2、 O78及O157血清型， 研制的多价大肠杆菌氢氧化铝胶和蜂胶佐剂灭活苗， 对同血清型菌株的攻击具有良好的保护作用。蜂胶佐剂疫苗免疫18～22 g的小鼠， 每只免疫0.3 mL， 免疫后10 d攻毒， 保护率为100％。氢氧化铝胶佐剂疫苗免疫18～22 g小鼠， 每只免疫0.5
mL， 免疫后10 d攻毒， 保护率为88％。该铝胶佐剂、 蜂胶佐剂疫苗安全有效， 接种后无不良反应， 使小白鼠对大肠杆菌的感染率和发病率有明显下降。用小白鼠检验疫苗的效力可降低检验成本， 缩短检验时间。免疫小白鼠在5～7 d内产生坚强的免疫力， 这也从另一方面说明了用小白鼠进行效检的可行性。在检验过程中发现， 攻毒后必须不断地给小白鼠更换垫料， 保持鼠盒内洁净干燥， 才能保证确实的检验效果， 否则无论攻几个细菌都能够引起小白鼠死亡， 使疫苗效力检验失败， 这可能与发病小白鼠不断排毒与再感染有关。通过用铝胶苗和蜂胶佐剂苗试验结果
表明， 对大肠杆菌病而言， 用蜂胶佐剂苗的效果优于铝胶苗。
参考文献
［1］张敬哲. 蜂胶的研究利用概况［J］. 特种经济动植物， 2006， 2: 13-14.
［2］王南舟. 复合蜂胶制荆调节肠道功能的体外实验研究［J］. 营养卫生， 2003， 24（3）: 119-122.
［3］王桂云， 于 赫， 于英君. 蜂胶提取物对小鼠胸晾一氧化氮与抗氧化作用的影响［J］. 中医药学报， 2004， 32(3): 67-68.
［4］Sahinler N， Kaftanoglu O. Natural product propolis: chemical composition［J］. Nat Prod Res， 2005， 19(2): 183-186.