类风湿性关节炎潜在的治疗靶点—NFκB刘明, 丁庆军 综述 梁统* 审阅

【摘要】 　　核转录因子NFκB在RA发病中起着中枢的作用， 其激活涉及许多致炎细胞因子的转录， 这些致炎细胞因子与RA的发病密切相关。以NFκB为主要靶点， 抑制其活性， 下调致炎细胞因子的表达， 为RA治疗提供了新的途径和方法。

【关键词】 NF κB 类风湿性关节炎 抑制剂 RNA干扰

　　核转录因子（Nuclear factorκB， NFκB）是一种广泛存在于各种类型细胞中的一种转录因子， 因其能与免疫球蛋白κ链基因增强子结合而得名。NFκB非正常的激活可导致类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis， RA）等多种疾病的发生。研究NFκB激活在疾病发病中的分子机制， 抑制NFκB信号途径的激活， 已成为当前国内外研究的热点。

　　1 NFκB在RA中的作用
　　
　　RA是一种以对称性、 多关节、 小关节病变为主要表现的慢性自身免疫性疾病。主要表现关节肿痛， 晚期发生强直、 畸形及功能障碍。虽然发病机制目前尚不十分清楚， 但个体先天易感性与环境间相互作用为基本的罹患因素已经明了。Okamoto等通过对日本的RA患者与正常人的一系列对照研究， 利用微卫星和大量的单核苷酸多态性、 插入/删除多态性分析， 确定IκBL基因上游62位的启动子为与HLA连锁的RA易感基因， 位于HLAⅢ区， 为单核苷酸多态性（SPNs）96452的T等位基因（T/A）， 它直接影响IκBL（与IκBα同源）的转录。这一发现从遗传学角度支持了NFκB信号通路异常活化在RA发病机制中的重要地位。哺乳动物细胞NFκB家族有5个成员: RelA(p65)， RelB， cRel， NFκB1（p50及其的前体p105）及NFκB2(p52及其前体p100)。Ⅱ型胶原和佐剂诱导的关节炎动物模型中， 关节滑膜液NFκB表达水平显著增加， RA滑膜中NFκB p50和p65的表达量比较丰富， 尤其是p65的表达。RA患者滑膜组织中有大量的RelA和NFκB1的表达; 成纤维样滑膜细胞中， IKK表达丰富， 其亚基IKKβ的活化是NFκB介导的IL6， IL8， ICAM1， MMP3和MMP13基因表达的关键因素。
　　
　　NFκB调节150多条基因的转录， 涉及免疫、 炎症、 凋亡、 细胞增殖和NFκB信号负反馈等， RA病理生理学的众多细胞因子和细胞黏附分子的激活， 都受到NFκB的转录调控。如细胞因子（如TNFα， IL1β， IL6， IL2， IL12， IFNγ， GMCSF）， 细胞黏附分子（如选择蛋白， VCAM1， ICAM1）， 化学增活素（如IL8， MIP1α， MCP1， RANTES， 嗜酸细胞活化趋化因子）， 基质金属蛋白酶（MMP1， MMP3， MMP13）， 受体（如MHC）和诱导酶（如环COX1， iNOS）［1］。临床研究显示， 在RA患者滑膜液中存在多种细胞因子， 形成极其复杂的相互调控的细胞因子网络。NFκB诱导炎症细胞因子TNFα， IL1β基因的表达， TNFα和IL1β大量存在于RA关节的滑膜液中， 是RA最重要的促炎性细胞因子。IL6是IL1β和TNFα的某些生物效应的放大因子， 可放大IL1β和TNFα对关节软骨的损坏作用。TNFα， IL1β， IL6等炎性细胞因子的存在， 刺激滑膜组织、滑膜细胞过度表达环氧合酶2（cyclooxygenase2， COX2）、一氧化氮合酶（nitric oxide synthase， NOS）， 引起PGE2及NO大量合成和释放。PGE2由花生四烯酸经环氧合酶（COX）代谢生成， 可引起炎性细胞浸润、滑膜组织异常增生、新生血管翳形成， 导致关节肿胀、蜕变。NO由NOS合成， NO可以通过改变滑膜细胞和软骨细胞代谢， 诱导软骨蛋白多糖降解， 干扰细胞外间质对软骨细胞功能的调节作用， 导致软骨细胞破坏和修复减弱， 增强滑膜微血管的通透性， 增加反应氧介质水平而介导关节损伤， NO还可以影响纤维母细胞样滑膜细胞诱导产生基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMPs）， 从而加重关节损伤。
　　
　　TNFα和IL1β还促进成纤维细胞增生激活并增强血管内皮细胞对黏附分子的表达， 介导关节炎细胞的吸收破坏。 TNFα、 IL1β还可以刺激B型滑膜细胞产生高水平的基质金属蛋白酶， 导致细胞外基质的破坏与重建， 加快了RA的破坏性进程。NFκB诱导炎症细胞因子TNFα和IL1β基因的表达， TNFα、 IL1β又正反馈调节NFκB的激活， 这种恶性循环导致持久的、膨胀的炎症反应。

　　2 NFκB抑制剂
　　
　　目前， 关于NFκB激活途径的有效抑制剂的报道越来越多， 许多已成为RA治疗的临床用药， 有非天然抑制剂、 天然抑制剂等。已报道的非天然类抑制剂包括NBD蛋白、 ML120B［2］、 组蛋白脱乙酰基酶抑制剂（HDI）［3］、 非甾体雌激素受体配基（WAY169916）、 脱羟甲基氧醌霉素复合物(DHMRQ)、 PGE2、 雄激素（DHT）、 糖皮质激素和环孢霉素A等。
　　
　　在胞质中， NFκB通常与IκB（inhibit κB）结合， 掩蔽NFκB的核定位序列， 使NFκB滞留在胞质中， 以无活性的形式存在。IKK（IκB kinase）复合体是NFκB激活的重要蛋白激酶， 催化IκB磷酸化诱导IκB家族成员IκBα、 IκBβ、 IκBε和p50的降解， NFκB被激活， 活化的NFκB以二聚体形式存在。IKK复合体至少有3个亚基组成， 包括激酶IKKα（IKK1）、 IKKβ(IKK2)及调节亚基IKKγ/ NEMO（NFκB essential modulator）。
　　
　　NBD（NFκB essential modulatorbinding domain peptide）蛋白是一种高特异性的IKKβ抑制剂， 能阻断NEMO与IKKβ相互作用， 从而阻断IκBα磷酸化， 抑制NFκB的活化。研究发现， NBD蛋白能有效阻断IL1β诱导的RA患者滑膜细胞IκBα磷酸化和IL6的表达。AA大鼠关节炎内注射NBD蛋白， TNFα和IL1β等致炎细胞因子水平显著下降， 滑膜液炎症和骨组织破坏减少， 关节炎严重度显著降低。这些研究结果暗示， 应用NBD蛋白特异性阻断的NFκB的激活， 也许是关节炎局部治疗的一种新的方法［4］。
　　
　　来源于植物的许多天然抑制剂， 能够调节致炎因子的表达， 有潜在的抗关节炎的功效， 包括黄酮类、 萜类、 醌类、 儿茶素、 生物碱类、 花青素类和花黄素等［5］。其中一些多酚类物质已用于关节炎治疗的试验， 包括水飞蓟素、 姜黄［6］、 睡茄交酯、 白藜芦醇、 茶多酚、 金雀异黄酮、 香胶甾酮、 乳香酸和槲皮素。其能阻断NFκB的激活， 抑制TNFα、 IL1β、 COX2、 脂氧合酶、 基质金属蛋白酶或黏附因子的表达。许多临床前和临床研究表明， 这些廉价的天然产物对关节炎治疗具有较大的潜力， 且无副作用。
　　
　　白藜芦醇是存在于花生、 葡萄中的一种多酚类物质。有研究表明［7］， 白藜芦醇能抑制小鼠皮肤IκBα磷酸化， 防止其降解， 从而抑制NFκB的激活。白藜芦醇还可减少p65的磷酸化， 减弱其与CBP/p300的相互作用， 使NFκB转录失活。白藜芦醇还能抑制IKK的激活， 阻断NFκB的激活， 以及COX2的表达。在兔关节炎模型中， 关节内注射白藜芦醇， 滑液炎症显著降低， 软骨中基质蛋白多糖的损失降低， 显著减少软骨的破坏。

　　3 NFκB与寡聚脱氧核苷酸
　　
　　NFκB圈套寡脱氧核苷酸 （NFκB decoy ODN）， 是含有NFκB结合位点的双螺旋寡核苷酸， 当NFκB从NFκBIκB复合物中解离出来后， NFκB圈套寡脱氧核苷酸即可与游离的NFκB结合， 从而封闭NFκB， 特异性阻断其向核内移位及启动靶基因的转录。Tomita等研究发现， 用携带NFκB圈套ODNs的HVJ脂质体转染滑膜细胞， IL1β， TNFα和ICAM1 mRNA的表达受到抑制， IL1β， IL6， TNFα， ICAM1和MMP1等细胞因子明显降低， 滑膜细胞的增殖受到抑制。在胶原诱导的RA大鼠模型中， 双侧后踝关节关节内注射NFκB圈套ODNs， CIA大鼠后足掌肿胀程度降低， 组织学和放射学观察关节破坏明显受到抑制， 关节滑膜中IL1β和TNFα产物的表达也受到抑制。关节内注射NFκB圈套ODNs， 明显改善关节炎症。
　　
　　ODNs在体内快速降解， 所以治疗中需要高剂量并连续给药。用病毒包装转染传递NFκB圈套 ODNs进入胞质已证明是有效的， 但临床的副作用和安全性需要严格的证明。通过NFκB圈套 ODNs调节NFκB的激活， 也许是控制炎症免疫反应疾病一种有效的治疗工具［8］。

　　4 NFκB与RNA干扰
　　
　　RNA干扰（RNA interference， RNAi）是近年来发现的利用外源性或内源性双链RNA以高度序列特异性方式抑制基因表达的过程， 不同于传统的基因敲除使目标基因永久型的表达沉默， 而是通过降解同源序列的靶mRNA， 达到基因表达的抑制， 具有效率高， 靶向性强等特点。

　　P65和p50是NFκB家族的重要成员， 在哺乳动物细胞中， p65/p50异源二聚体是NFκB存在的最广泛的形式。Lee等研究发现， 在RA患者成纤维样滑膜细胞（FLS）中， 特异的p65和p50 siRNA能抑制NFκB的激活， 阻断包括炎症细胞因子， 化学增活素和抗凋亡基因等下游靶基因的表达。P65 siRNA有效的下调FLS p65的表达， 强烈抑制IL6， IL8和cIAP2靶基因的转录。因此， 靶向NFκB亚基的siRNA， 为RA的治疗提供了一种有效的对策。有文献报道， 特异的NFκB p65 siRNA能抑制p65的表达和NFκB的激活， 显著减少软骨细胞IL1β和TNFα诱导的COX2， NOS2和MMP9的表达［9］。Denise Smith等用cRel和RelA shRNA转染成胶质细胞瘤/星形细胞瘤， 抑制NFκB活化， 大约90%的细胞增殖受到抑制［10］。
　　
　　为了提高转染率， 利用携带siRNA目的片段的病毒载体转染靶细胞， 能达到更好的沉默效果。最近有报道［11］， 腺病毒载体介导的特异的NFkB p65 siRNA能有效抑制NFκB的激活和膝盖软骨及滑膜细胞中p65的表达， 抑制滑液中IL1β和TNFα的诱导作用， 减轻滑膜炎症并减少早期实验性OA软骨的分解。因此， 特异的NFκB p65 siRNA在OA或RA疾病早期阶段的预防和治疗中， 有潜在的意义。
　　
　　IKKβ是NFκB途径激活主要激酶， 已成为RA治疗特别具有吸引力的靶目标。Tas等［12］用重组腺相关病毒（recombinant adenoassociated virus， rAAV）包装显性负相IKKβ基因， 关节内注射入佐剂大鼠关节内， 早期关节炎大鼠足肿胀明显减轻， 免疫组织化学分析， 滑膜组织IL6和TNFα水平下降， 而IL10水平未受影响。此研究首次证明：rAAV载体携带治疗基因（显性负相IKKβ）成功转染滑膜细胞， 减轻体内AA炎症的严重度， 减少体外RA滑膜组织致炎细胞因子产物。
　　
　　Ogawara等［13］构建了一种αvβ3整合素特异性腺病毒， 用该病毒编码的显性负相IκB (dnIκB)转染内皮细胞， 阻断NFκB信号的转导， 导致人脐静脉内皮细胞TNFα诱导的E选择蛋白， ICAM1， VCAM1， IL6， IL8， VEGFA 和Tie2增量调节的完全抑制。靶向传递dnIκB入内皮细胞的方法， 可以应用在类风湿性关节炎和炎性肠炎等疾病中。Amos等［14］用高效的腺病毒转移IκBα基因， 研究NFκB在调节后期OA滑膜炎症和破坏介质中的作用。发现IκBα过度表达时， 抑制TNFα的表达， 但IL1未受影响。同时发现， IL6， IL8， 粒细胞巨噬细胞集落细胞刺激因子和制瘤素M的表达也被有效的抑制。基质金属蛋白酶1， 3， 9和13也被IκBα过度表达所抑制。此团队的最近一篇文章［15］报道， 同样用腺病毒携带目的基因IκBα转染OA滑膜细胞， IL8的水平未受影响。

　　5 结语
　　
　　NFκB信号途径的激活， 调节许多炎症基因的表达， 如TNFα和IL1β等， 这些炎症性细胞因子的表达在RA发病中起到关键的作用。因此， 控制NFκB途径的非正常激活， 下调炎症性细胞因子的表达， 成为RA治疗的新的途径。RNA干扰是一种新颖的特异性的基因沉默方式。以NFκB为作用靶点， 利用RNA干扰技术， 抑制NFκB的表达， 为RA的临床治疗带来了新的前景。如何选择有效的作用位点， 减少非靶效应的影响， 提高siRNA传递效率和稳定的表达， 避免一些抗RNAi病毒防御系统的进化， 是RNA干扰技术应用亟待解决的问题。

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