氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、 鉴定及应用

【摘要】 目的: 制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定与应用。方法: 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体， 用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠， 采用杂交瘤技术制备mAb， 并通过间接ELISA法、 Western blot、 免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定， 通过免疫沉淀联合质谱、 UniZAP XR表达文库筛选鉴定抗原， 借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物。结果: 获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb 的杂交瘤细胞系。mAb的Ig亚类(型)为IgG1（κ）， 该 mAb可用于ELISA检测、 Western blot、 免疫组化、 免疫荧光染色、 免疫沉淀实验和复合物的分离。结论: 成功制备了抗人CPSI的mAb， 为CPSI的研究提供了有力的工具。

【关键词】 氨甲酰磷酸合成酶(CPSI) 单克隆抗体 特性

　　氨甲酰磷酸合成酶（human carbamyl phosphate synthetase 1， CPSI/EC 6.3.4.16）是肝脏细胞能量代谢中尿素循环中的关键酶， 而尿素循环的代谢途径为肝脏细胞线粒体的一项主要功能， 氨甲酰磷酸合成酶可以去除细胞中多余的氨， 此酶缺失可以导致高氨血症。我们在成人肝脏线粒体单克隆抗体(mAb)库的建立中， 应用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠制备mAb， 获得3株鼠抗人CPS1 mAb， 并对其特异性进行了鉴定。这为进一步研究CPS1在代谢中的作用提供参考。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　免疫和筛选用成人肝组织线粒体总蛋白， 由本室制备; 弗氏佐剂购自Sigma公司; 羊抗鼠IgGHRP购自中山公司; 蛋白酶抑制剂购自Roche公司; HiTrapTM Protein G HP抗体纯化柱购自Amersham公司; BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司; PVDF膜购自Amersham公司; ECL反应试剂盒购自Amersham公司; 半干转印仪购自BioRad公司; DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机购自宁波新芝生物科技股份有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备

　　成人肝组织匀浆700～750 r/min， 10 g组织加40 mL匀浆缓冲液800 g离心10 min， 取上清， 10 000 g离心10 min， 沉淀即为线粒体， 用匀浆缓冲液洗2次。用RIPA裂解液裂解线粒体样品， 离心后取上清， 获得线粒体总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度， 计算线粒体的得率， 通过测定匀浆液和分离的线粒体中的琥珀酸脱氢酶的活性计算线粒体的富集度， SDSPAGE鉴定抗原的相对分子质量(Mr)。

　　1.2.2 鼠抗人mAb的制备

　　将线粒体总蛋白1 mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化， 多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫1次， 1周后经尾静脉取血， 分离血清， ELISA法测定效价。融合前3 d进行加强免疫， 取小鼠脾细胞与X653细胞进行细胞融合， 采用杂交瘤技术制备mAb
。

　　1.2.3 抗原的鉴定

　　 (1)抗原的质谱鉴定: 应用mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀抗原， 并进行SDSPAGE电泳， 根据Western blot结果显示的阳
性条带， 从SDSPAGE胶上切下相应的条带， 酶切， 质谱鉴定。(2)抗原的UniZAP XR表达文库筛选鉴定: 取大肠杆菌XL1BLUE MRF’过夜培养菌接种于LB培养液中， 37℃震荡培养至A600为0.7左右， 3 000 r/min下离心10 min， 用10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至A600为0.5， 取适当稀释的文库60 μL(含约50 000个噬菌体)与600 μL重悬的XL1BLUE MRF'混匀后37℃温育20 min， 铺至150 mm的NZYLB平板上， 42℃倒置培养至噬菌斑模糊可见， 将浸泡过IPTG的NC膜覆盖表面， 37℃继续培养3.5 h， 用防水墨水定位后， 剥离滤膜， 进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆， 用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、 测序及Western blot分析。

　　1.2.4 mAb的鉴定

　　(1)Western blot 分析: 线粒体总蛋白经SDSPAGE后， 电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1 h， 然后加入1∶
2 000稀释的mAb， 室温下孵育2 h， TBST缓冲液洗膜后， 加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶5 000稀释）， 室温下孵育1 h， TBST缓冲液洗膜后， ECL法显色。(2)免疫组化鉴定: 用丙酮固定的冰冻成人肝组织切片， PBST浸洗3 min后每个组织片滴加25 mg/L的Avidin 50 μL， 室温孵育15 min， 滴加h3O2甲醇， 室温孵育15 min。滴加正常羊血清室温下封闭20 min， 加入1∶100稀释的鼠抗人CPS1 mAb， 4℃孵育过夜。PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP， 37℃孵育30 min， PBS洗片后进行DAB显色， 苏木素复染， 返蓝后封片。(3)免疫荧光染色: 取liver carcinoma cells (HCV)细胞， 用2.5 g/L胰蛋白酶消化， 制成单细胞悬液， 将细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中， 置50 mL/L CO2， 37℃孵箱中培养1～3 d， 待细胞接近长成单层， 加入适当稀释的罗丹明123， 置50 mL/L CO2， 37℃孵箱中培养30 min， 取出盖玻片， 浸入PBS（0.01 mol/L， pH7.4），
洗2次。40 g/L多聚甲醛（1 g/L Tween20）固定5 min。将已固定的细胞玻片用PBS振洗5 min， 取出吹干。加羊血清封闭37℃， 30 min。滴加适当稀释的特异抗体（线粒体蛋白mAb）， 置湿盒内， 37℃保温30 min。TBST振洗3次。滴加适当稀释的荧光素抗体（罗丹明标记山羊抗小鼠IgG）（Rhodamine（TRITC）conjugated AffiniPure Goat AntiMouse IgG(H+L)， 37℃保温30 min。TBST振洗3次， 蒸馏水振洗1次。50 mL/L缓冲甘油封片， 荧光显微镜观察， 拍照。

　　1.2.5 mAb的应用

　　抗体用于复合物的分离， 取成人肝脏组织线粒体加入20 g/L ndodecylβDmaltoside， 冰浴30 min， 180 000 g
离心30 min， 取上清A。将25 mmol/L dimethylpimelimimidate， BEH045 mAb， ProteinG， 混合30 min。3 000 r/min， 离心1 min， 弃上清， 加入0.2 mol/L乙醇胺， 混合3 h。3 000 r/min， 离心1 min， 弃上清， 加入1 mL磷酸盐缓冲液重悬沉淀， 加入上清A， 4℃混合过夜。3 000 r/min， 离心1 min， 弃上清， 沉淀用磷酸盐缓冲液加入0.5 g/L ndodecylβDmaltoside洗6次。用2倍柱体积的0.1 mol/L甘氨酸洗2次， 离心后取上清。上清用Mr为3 500超滤管超滤浓缩， 用于一维、 二维电泳。

　　2 结果

　　2.1 成人肝组织线粒体总蛋白抗原的制备

　　通过差速离心方法分离线粒体， 每克肝组织可得到8～10 mg线粒体蛋白。通过测定琥珀酸脱氢酶活性并计算线粒体富集度， 多次结果显示为线粒体富集度为4～7倍。成人肝组织线粒体总蛋白经SDSPAGE， 显示其Mr主要分布在25 000～75 000之间， 与文献报导一致［1］， 可作为免疫动物的抗原。

　　2.2 鼠抗人mAb的制备及初步鉴定

　　应用细胞融合、 筛选和克隆化， 共获得23株抗人肝脏线粒体阳性的细胞株。其中1株BEH045经ELISA检测效价约为1∶128 000， 其亚类（型）为IgG1（κ）。

　　2.3 抗原特异性鉴定

　　(1)抗原的质谱鉴定: IP和Western blot结果显示。在23株杂交瘤细胞中， BEH045可特异识别成人肝组织中Mr约为160 000的蛋白（图1）。应用BEH045 mAb从线粒体总蛋白中免疫沉淀相应的抗原， 并进行SDSPAGE电泳， 从SDSPAGE胶上切下Mr约为160 000的蛋白， 质谱鉴定结果为氨甲酰磷酸合成酶。(2)抗原的UniZAP XR表达文库筛选鉴定: 用获得的BEH045的细胞培养上清对肝脏cDNA表达文库进行筛选， 以50 000个克隆的密度铺板， 筛选阳性克隆， 分离独立的阳性克隆进行体内剪切和测序。测序结果表明， BEH045识别的蛋白为CPSI， Mr为160 000， 与免疫沉淀结果一致。为了进一步证明筛选的可靠性， 又对分离到的阳性克隆进行了Western blot鉴定。结果显示， 抗体BEH045与诱导后的细菌总蛋白有特异的反应条带， 位于Mr约为160 000处， 与用pBlueScript SK载体构建cDNA文库进行融合表达的蛋白Mr一致。因此， BEH045识别的蛋白为CPS1［2］。

　　2.4 mAb的免疫组化鉴定

　　免疫组化结果显示， 鼠抗人CPS1 mAb所识别的分子位于肝细胞的胞质（图2）。

　　2.5 mAb的亚细胞定位

　　免疫荧光染色结果显示， 鼠抗人CPS1 mAb所识别的分子位于肝细胞的线粒体（图3）。

　　2.5 mAb分离复合物

　　借助免疫沉淀的方法， 应用BEH045 mAb分离相应抗原及抗原相关蛋白质， 从电泳图中可以看出有多条蛋白质条带（图4）， 而Western blot结果显示BEH045 mAb识别的蛋白质Mr在160 000左右， 那么未被BEH045 mAb识别的蛋白质有可能是BEH045 mAb识别的蛋白质CPS1复合物的组成部分或相关蛋白质。将BEH045 mAb捕获的蛋白质进行双相电泳， 胶上蛋白质酶切， 质谱分析， 结果鉴定出7种蛋白质（human carbamy1 phosphate synthetase I， 78 000 glucoseregulated protein precursor， nonspecific lipidtransfer protein mitochondrial precursor， protein disulfide isomerase A3 precursor， argininosuccinate synthase， stress70 protein mitochondrial precursor， hypothetical protein DKFZp686J18235）。

　　这些酶与葡萄糖代谢中的尿酸循环、 TCA循环、 氨的代谢和脂类代
谢有关。

　　3 讨论

　　本研究旨在分离人肝脏细胞线粒体， 用总蛋白免疫小鼠， 并进行了3次细胞融合， 共获得了23株杂交瘤细胞株。所获得的抗体中有3株（MBEH045、 MAAD309、 MBFG021）是针对CPS1的mAb。Western blot结果显示抗体识别的蛋白Mr在160 000左右。

　　CPSI 由位于染色体2q35的CPSI基因编码。人CPSI基因有&>120 000的基因组DNA， 有38个外显子和37个内含子。CPSI的前体（165 000）在胞质中合成， 而后转运到线粒体裂解为成熟的酶（160 000）［3］。CPSI活性的调节依赖于N乙酰谷氨酸的水平。CPS1是尿酸循环的一个酶， 特异地表达于肝脏的线粒体和小肠的内皮细胞［4］。CPS1缺失可引起尿酸循环障碍导致高氨血症［5］。CPSI缺失(CPSID)为常染色体隐性遗传， 表现为婴儿期破坏性的代谢疾病或晚期更严重的发作。氨甲酰磷酸合成酶的单克隆抗体有可能研制成为特异识别氨甲酰磷酸合成酶的试剂从而为临床诊断与治疗提供帮助。

　　CPSI在体内是以复合物的形式存在的。以往的研究结果表明CPS1与线粒体中天冬氨酸氨基转移酶能够形成复合物， 但与尿酸循环中其他酶的关系尚未充分阐明。因此对于将来更好地研究CPS1复合物的结构和功能， 更充分地了解尿酸循环的分子机制， BEH045 mAb是一个很好的工具。抗体捕获组分的分析有助于蛋白质复合物及其相互作用的研究， 也在新的蛋白质发现和确认方面提供重要信息和证据。

参考文献

　　［1］Mootha V， Bunkenborg J， Olsen J， et al. Integrated analysis of protein composition， tissue persity， and gene regulation in mouse mitochondria［J］. Cell， 2003， 115（5）: 629-640.

　　［2］Gao J， Gao Y， Ju Y， et al. Proteomicsbased generation and characterization of monoclonal antibodies against human liver mitochondrial proteins［J］. Proteomics， 2006， 6(2): 427-437.

　　［3］Summar ML， Hall LD， Eeds AM， et al. Characterization of genomic structure and polymorphisms in the human carbamyl phosphate synthetase I gene［J］. Gene， 2003， 311: 51-57.

　　［4］ Funghini S， Donati MA， Pasquini E， et al. Structural organization of the human carbamyl phosphate synthetase I gene (CPS1) and identification of two novel genetic lesions［J］. Hum Mutat， 2003， 22(4): 340-341.

　　［5］Pearson DL， Dawling S， Walsh WF， et al. Ureacycle intermediates， nitric oxide production， and carbamoylphosphate synthetase function［J］. N Engl J Med， 2001， 344(24): 1832-1838.ISSN1007-8738细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2008， 24(5)·论著·