NE(MHS)纳米乳剂疫苗的抗肿瘤免疫学效应研究

【摘要】 目的: 制备包裹有MAGE1Hsp70和SEA的复合抗原的纳米乳剂疫苗NE（MHS）（nanoemulsionencapsulated MAGE1Hsp70/SEA）， 评价其抗肿瘤免疫学特性。方法: 采用磁力超声法制备纳米疫苗NE（MHS）， 评价其粒径、 包裹率及稳定性; NE（MHS）免疫动物， IFNγ ELISPOT和LDH杀伤实验检测疫苗激活机体特异性细胞免疫反应情况; 肿瘤攻击实验检测纳米乳剂疫苗的抗肿瘤效应。结果: （1）成功制备出粒径为（20±5） nm的NE（MHS）， 其药物包裹率为87%， 于4℃放置6个月后或3000 r/min 10 min离心后无分层; （2）与其他组相比， NE（MHS）组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFNγ的T细胞数量明显增多（P&<0.05）， CTL对B16MAGE1的特异性杀伤作用明显增强; NE（MHS）组B16MAGE
1肿瘤成瘤时间长、 成瘤率低。结论: NE（MHS）纳米乳剂疫苗具有良好的理化性质， 能够刺激机体产生强烈的MAGE1特异性的细胞免疫， 能有效预防表达MAGE1的肿瘤细胞攻击， 是一种很有希望的新型抗肿瘤疫苗。

【关键词】 纳米乳剂 肿瘤疫苗 MAGE1 Hsp70 SEA

　　肿瘤疫苗作为预防肿瘤患者术后复发和转移的有力手段， 近年来已得到广泛的研究和应用。目前， 已有多种疫苗进入临床试验阶段。但是由于肿瘤免疫反应的复杂性， 肿瘤疫苗距成为治疗型疫苗并真正走向临床实际应用尚有距离。考量各方面因素、 综合各设计方案， 本实验拟在已有研究的基础上， 对所构建的肿瘤基因工程纳米疫苗进一步改进， 并研究其抗肿瘤免疫学特性， 为疫苗走向临床前研究打下实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　大豆油、 poloxamer 188、 span 80购自美国Gibco公司。C57BL/6小鼠由第四军医大学动物中心提供。MAGE1Hsp70蛋白、 SEA蛋白由本实验室表达纯化制备。转MAGE1基因的小鼠黑色素瘤细胞由本实验室叶菁博士构建。ELISPOT检测试剂盒购自法国DIACLONE公司。

　　Cytotox96检测试剂盒购自美国Promega公司。

　　1.2 油包水型纳米乳剂NE（MAGE1/Hsp70+SEA， MHS）的制备
　　采用磁力超声法。具体: 1.0 mg复合抗原（融合蛋白MAGE1/Hsp70与超抗原SEA按摩尔比100∶1混合）、 80 g/L Span20、 180 g/L Pluronic188和0.6 mL大豆油， 双蒸水调整体积为2.5 mL， 混合均匀得到油相; 在3000 r/min磁力搅拌下， 将油相逐滴加入7.5 mL双蒸水水相中; 将混合物移至真空高速剪切乳化机上， 在0.7 kpa真空下， 23000 r/min， 高速剪切40 min， 温度控制在80℃以下; 冰浴下40 kHz超声5 min， 反复3次， 即得到纳米疫苗（0.1 g/L）。用0.22 μm的滤膜过滤除菌后， 于4℃保存。

　　1.3 NE（MHS）的性质鉴定

　　1.3.1 形态观察

　　将制成的NE（MHS）100倍稀释于生理盐水中， 取100 μL滴于400目铜网上， 1 min后吸去上清， 10 g/L磷钨酸染色1 min， 自然晾干后在透射电子显微镜下观察其形态。

　　1.3.2 粒径检测

　　将采集的图象经计算机图象分析求得NE（MHS）的平均粒径。

　　1.3.3 包裹率及稳定性测定

　　采用SephedexG100凝胶层析法， 洗脱液为PBS， 流速为0.5 mL/min。取NE（MHS） 1.0 mL上柱， 收集游离峰即为游离的MHS。将收集的游离MHS用分光光度计测定A280值。同时制备不同浓度的MHS标准蛋白样品， 用分光光度计测定其光度值， 并绘制浓度与
光度值的标准曲线。以标准曲线为依据， 计算出NE（MHS）中游离MHS的含量。

　　包裹率按公式计算: 包裹率=(W总－W游)/W总×100%。（W总为制备时所用MHS的总量， W游为游离的MHS的量）。将制备的NE（MHS）置于4℃冰箱保存6个月后或3000 r/min 10 min离心后， 电镜观察纳米乳剂形态， 明确其稳定性。

　　1.4 纳米乳剂蛋白疫苗的细胞免疫反应

　　1.4.1 动物的分组、 免疫和小鼠脾淋巴细胞的分离与活化 取4～6周龄的二级C57BL/6小鼠(H2b)， 雌雄不拘， 体质量(18±2) g， 随机分为6组， 每组6只。分组情况为: (1)PBS对照组: PBS 0.15 mL/鼠; (2)NE（－）对照组: 空白纳米乳剂0.15 mL/鼠; (3)MAGE1Hsp70免疫组: 注射MAGE1Hsp70融合蛋白14 μg（150 pmol/L）; (4)NE（MAGE1Hsp70）免疫组: 注射纳米乳剂包裹的MAGE1Hsp70融合蛋白疫苗14 μg（150 pmol/L）; (5)MAGE1Hsp70/SEA免疫组: 注射MAGE1Hsp70融合蛋白14　　μg（150 pmol/L）和SEA蛋白0.042 μg（1.5 pmol/L）; (6)NE（MHS）免疫组: 注射纳米乳剂包裹的MAGE1Hsp70/SEA复合蛋白疫苗14 μg（150 pmol/L）。各组分别在1 d、 11 d和21 d腹腔注射免疫， 注射体积均为每次150 μL/鼠。末次免疫后10 d， 无菌取小鼠脾脏， Ficoll淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。

　　1.4.2 分泌IFNγ的MAGE1特异性T细胞的检测（IFNγ ELISPOT）

　　分别以所获得的小鼠脾淋巴细胞为效应细胞， 分别以转染MAGE1阳性的B16细胞和未转染MAGE1的B16细胞为靶细胞， 每组同时设立不加靶细胞的阴性对照孔和PHA刺激阳性对照孔。用抗小鼠IFNγ的底层抗体包被PVDF板， 反应孔加入按20∶1比例的效应细胞和靶细胞， 37℃反应20 h后洗涤并加上层抗体及酶标二抗。避光显色20 min， 蒸馏水冲洗终止反应。1200 dpi扫描读取斑点数。用实验孔斑点数减去阴性对照孔斑点数后求出每组的平均值。

　　1.4.3 细胞毒性试验（Cytotox 96， Promega）

　　以小鼠的脾淋巴细胞为效应细胞， 以转染MAGE1阳性的B16细胞和未转染MAGE1的B16细胞为靶细胞， 按效靶比(E∶T ratio) 2.5∶1、 5∶1、 10∶1混合2组细胞， 37℃培养4 h后采用LDH法检测杀伤率。

　　1.5 肿瘤攻击实验

　　C57BL/6小鼠60只， 雄性， 随机分为6组， 每组10只。小鼠腹腔注射疫苗， 分组及免疫剂量同实验1.4.1， 分别于首次免疫后7 d、 14 d后以相同剂量追加免疫2次。末次免疫后7 d于小鼠右后肢皮下接种1×105 B16MAGE1细胞。观察并记录小鼠成瘤率， 绘制KaplanMayerr曲线。

　　1.6 统计学处理

　　所有数据的统计和分析采用SPSS11.5软件进行， 组间比较采用方差分析， P&<0.05为组间具有统计学意义。KaplanMayer存

活曲线的Fisher’s exact检验分析不同分组的生存期。

　　2 实验结果

　　2.1 纳米疫苗NE（MAGE1Hsp70/SEA）的性质

　　纳米乳剂为乳白色的均质胶体混悬液， 在透射电子显微镜下观察发现纳米乳剂呈球形（图1）， 大小较均匀， 将采集的图象经计算机图象分析得出纳米乳剂平均粒径为(20±5) nm。经计算得出， 包裹率为87%。于4℃放置6个月或3000 r/min 10 min离心后， 外观依然为均质胶体混悬液， 无分层和沉淀现象。电镜观察颗粒大小无变化。

　　2.2 ELISPOT检测脾淋巴细胞IFNγ释放细胞数量

　　B16MAGE1为靶细胞时， MH、 NE（MH）、 MHS和NE（MHS）组均有特异性T淋巴细胞， 与空白NE组、 PBS组相比， IFNγ释放细胞频数有统计学意义; 其中NE（MHS）组免疫的小鼠脾淋巴细胞中针对MAGE1的特异性T细胞的数量高于MHS组（P&<0.01）， NE（MH）组高于MH组（P&<0.01）， MHS组高于MH组、 NE（MHS）组高于NE（MH）组（P&<0.05）。以B16为靶细胞时， 各组均可见少量非特异分泌IFNγ的细胞（图2）。

　　2.3 细胞毒性实验

　　在效靶比为2.5∶1、 5∶1和10∶1的情况下， PBS组、 NE（）组脾淋巴细胞对B16MAGE1细胞无杀伤作用; MH组、NE（MH）组、 MHS组和NE（MHS）组脾淋巴细胞对B16MAGE1细胞的特异性杀伤作用均高于PBS组、 NE（）组， 而且NE（MH）组、 NE（MHS）组特异性杀伤作用分别明显大于MH组、 MHS组， 说明以纳米乳剂为药物载体包裹融合蛋白或复合蛋白后， 对表达MAGE1的肿瘤细胞的特异性杀伤作用明显强于未包裹MH、 MHS疫苗， 能诱导产生较未包裹MH、 MHS疫苗更强的特异性CTL; 6组中以NE（MHS）组免疫的小鼠脾淋巴细胞特异性杀伤能力为最高。各组对B16的杀伤能力均低（图3A、 B）。

　　2.4 纳米疫苗对肿瘤攻击鼠的保护效果

　　PBS组和NE（）组的小鼠均在10 d内成瘤; 21 d时， MH组10只小鼠全部成瘤， MHS组和NE（MH）成瘤小鼠分别为7只和3只， 而NE（MHS）组10只小鼠中均无肿瘤生长; 32 d时， NE（MH）组和NE（MHS）成瘤小鼠分别为6只和3只， 而其他组10只小鼠均成瘤; NE（MHS）组最后1只小鼠的成瘤时间为56 d。可见NE（MHS）对表达MAGE1抗原肿瘤攻击的小鼠有明显的保护效果（图4）。

　　3 讨论

　　ELISPOT和LDH释放实验结果显示， 经纳米乳剂包裹的NE(MHS)、 NE(MH)疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中MAGE1特异性T细胞数量分别较未包裹的MHS、 MH裸蛋白明显升高， NE（MHS）与NE（MH）相比， 以前者为最高; NE（MHS）免疫的小鼠诱导的CTL对B16MAGE1的特异性杀伤率明显大于MHS蛋白疫苗， NE（MH）大于MH， NE（MHS）大于NE（MH）， 证实与其他组相比， 纳米乳剂包裹的MHS复合蛋白疫苗能诱导最强的MAGE1特异性的细胞免疫反应， 其作用明显强于未经包裹的复合蛋白疫苗和未加入SEA的NE（MH）蛋白疫苗。肿瘤攻击实验显示纳米乳剂复合抗原疫苗NE（MHS）能有效延迟B16MAGE1瘤细胞对小鼠攻击的成瘤时间、 降低成瘤率。
　　
　　纳米乳剂疫苗取得上述良好免疫效果， 主要原因分析如下: 一是选择肿瘤特异性抗原MAGE1为疫苗的核心。肿瘤疫苗发挥关键作用的成分是肿瘤抗原。MAGE1是到目前为止经实验证实的具有良好激活机体抗肿瘤免疫反应的少数肿瘤特异性抗原（TSA）之一。MAGE1不仅在黑色素瘤表达， 同时在其他多种肿瘤中均有不同程度的表达， 但在除睾丸和胎盘外的正常组织中均不表达， 故成为肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子[1， 2]。二是采用Hsp70MAGE1融合蛋白， 利用Hsp70的分子伴侣作用加强APC细胞对抗原的加工递呈， 从而有效增强肿瘤疫苗的抗肿瘤免疫效果。我们以往的实验结果显示[3， 4]， Hsp70能够增强MAGE1Hsp70融合基因疫苗和MAGE3Hsp70融合蛋白疫苗的CTL效应; 将Hsp70与肿瘤抗原融合表达的融合蛋白是二者联合使用的最有利形式。三是加入超抗原SEA可有效激活CD4+T细胞， 协同加强肿瘤抗原的免疫效果。在机体抗
肿瘤免疫反应的过程中， 仅有CD8+T的激活并不能起到有效的杀伤肿瘤作用， CD4+T细胞的参与是必不可少的。超抗原葡萄球菌肠毒素A（SEA）是一种具有强大免疫激活性能的超抗原， 可以有效激活CD4+T细胞， 进而激活CTL， 导致对肿瘤细胞的杀伤， 具有高效免疫活性。研究结果显示， pg级的SEA即可引发高效的免疫激活效应[5]， 动物实验显示可有效激活系统和肿瘤局部的免疫活性， 抑瘤效果明显， 荷瘤动物的生存期明显延长， 且未观察到明显的毒副作用和免疫耐受现象的出现[6]。我们的研究还发现， 将超抗原SEA以1∶100的比例与MAGE1肿瘤抗原混合， 即可诱发高效的针对表达该抗原的肿瘤细胞的免疫排斥反应， 同时， 由于用量极低， 尚可有效避免毒性和免疫耐受的出现。四是选择纳米乳剂为疫苗载体， 充分发挥纳米药物载体的优良特性。(1)纳米乳剂保护、 缓释肿瘤抗原， 进而增强其生物利用度。特别是油包水型（W/O）纳米乳剂
， 其外油层表面具有隔断和保护内容物免遭酶及体液的破坏作用， 随着油相脂解， 包裹在里面的蛋白质缓慢释放。这种缓释作用持续刺激免疫系统， 生物利用度相应提高。(2)纳米乳剂可促进APCs提呈抗原。我们的实验证实[7]， 用纳米乳剂包裹模式蛋白BSA的体外细胞摄取实验中已发现， 载药纳米乳剂可明显增强DC和巨噬细胞对所载药物的摄取。(3)纳米乳剂具有亲淋巴系统被动靶向特性[8]。有实验证实， 纳米乳剂经局部注射后能定向进入淋巴循环， 聚集在区域淋巴结内; 经淋巴引流的纳米乳剂还可刺激局部淋巴结淋巴细胞增殖产生特异性免疫应答; (4)纳米乳剂乳化过程温和， 不会改变多肽类药物的生物活性; 且所用成分均为生物材料， 低毒、 安全[9]。

　　肿瘤的低免疫原性和机体的低免疫反应性大多数情况下在同一机体是同时存在的， 肿瘤免疫治疗想取得预期的治疗效果， 必须从多方面综合入手。设计者需同时考虑到调动机体的特异和非特异免疫， 激活CD8+和CD4+T细胞以及改善APC细胞抗原提呈功能、 增加疫苗的生物利用度等多方面因素[10]。在本实验制备的肿瘤基因工程纳米疫苗可以增强所载抗原的生物利用率， 促进抗原的摄取提呈， 增强机体的抗肿瘤免疫反
应， 是一种高效的肿瘤疫苗。

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　　T7噬菌体衣壳蛋白P11的原核表达、 纯化及其单克隆抗体的制备