重组人Era蛋白的可溶性表达、 纯化及生物学活性测定

　　　　 作者：吴元明， 张晓楠， 邢小红， 张俊杰， 陈南春， 陈苏民

【摘要】 　　目的: 为了得到可溶性表达的人Era（hEra）蛋白， 并检测其生物学活性。方法: 把人era的cDNA基因从pUC19质粒亚克隆入表达质粒pMALp2x中。pMALhEra转化大肠杆菌TB1， 用异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）诱导表达。 结果: pMALhEra载体表达的融合蛋白是以可溶状态存在， 表达量占菌体总蛋白的23.9%。再利用直链淀粉亲和色谱柱对表达的融合蛋白进行纯化， 接着用因子X将融合部分切除， 但切除后的hEra蛋白不稳定， 随着时间的延长而被降解。活性测定结果表明人Era蛋白能与GTP结合， 并具有GTP酶的活性。结论: 可溶性表达了人Era蛋白， 并用体外实验证实人Era蛋白是一种G蛋白， 这对人era基因的功能研究具有重要意义。

【关键词】 人Era 可溶性表达 生物活性测定

　　[Abstract] AIM: To prepare a soluble human Era(hEra) protein and to measure its bioactivity. METHODS: Human era cDNA gene from pUC19 plasmid was subcloned into the expression plasmid pMALp2x. pMALhEra was transducted to E.coli TB1 and the strain was induced by isopropyl βDthiogalactopyranoside (IPTG). RESULTS: The expressed MBPfused protein existed in a soluble form. The fused protein made up 23.9% of the total cell lysate. It was purified by amylose affinity chromotography and digested with Factor X. Although the fused segment was dissected， the remained hEra protein was unstable in the solution with the passage of time. The activity assay showed that hEra wasa GTPase that could bind GTP and hydrolyze GTP to GDP. CONCLUSION: Human Era protein can be expressed in a soluble form and it has been proved to be a kind of G protein by the experiments in vitro. The study is important to further research into the function of human era gene.

　　[Keywords]human Era; soluble expression; bioactivity assay

　　era基因是1986年在大肠杆菌中发现的， Era与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处，命名为大肠杆菌Ras样（E.coli Raslike）基因[1]。era基因在原核生物中普遍存在， 在真核生物如蠕虫、 小鼠、 人、 植物中也存在与细菌era高度同源的基因。Era蛋白是小G蛋白家族的新成员， 和其他小G蛋白不同的是， 其羧基端含有一个KH结构域。实验发现Era蛋白可以特异地与16SrRNA结合[2]， 这可能与其含有的KH结构域有关。Sharma等[3]通过电镜技术在嗜热栖热菌细胞内观察到30S和Era蛋白的复合体， 接着Inoue等[4]又利用细菌突变技术说明Era参与了细菌的核糖体生物合成。era是大肠杆菌中可以正常表达的基因， 但表达水平极低。遗传学实验证实era基因与细胞周期和细胞分裂有关， 是细菌生存繁殖所必需的重要基因。
　　
　　陈苏民等相继克隆了人及小鼠全长的eracDNA基因。人eracDNA基因全长约2.2 kb， 含长度为1038 bp的开放读框， 编码346氨基酸的蛋白质。人Era（hEra）与大肠杆菌Era (eEra)蛋白全序列比较， 有31%相同、 53%相似。同样， hEra也是由N端的GTPase结构域和C端KH结构域所构成。有报道称哺乳动物的Era可能是一个凋亡调节因子[5]， 但其具体功能还不清楚。本研究我们旨在得到可溶性表达的人Era(hEra)蛋白， 并检测其生物学活性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 pMALp2x和TB1菌种为本实验室保存。限制性内切酶， 异丙基硫代βD半乳糖苷(isopropyl βDthiogalactopyranoside， IPTG)， DL 2000 DNA marker购自TaKaRa公司。DNA片段的回收试剂盒: NucleoTrapTM Nucleic Acid purification Kits购自CLONTECH公司。直链淀粉树脂， 麦芽糖结合蛋白（maltose binding protein， MBP）， BSA为NEB公司产品。α32PGTP为北京亚辉生物医学工程公司产品。塑基薄层析片PEIcellulose F购自MachereyNagel公司， 硝酸纤维素膜购于华美公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pMALhEra表达载体的构建 用BamH I和Pst I两个酶切位点将pUC19hEra中的hera基因片段亚克隆入pMALp2x载体， 然后转化TB1感受态细胞。挑取单个菌落， 提取质粒后经酶切鉴定， 阳性质粒命名为pMALhEra[6]。

　　1.2.2 人era cDNA基因在大肠杆菌中的表达 将含重组表达质粒pMALhEra的单个菌落接种于5 mL含Amp的LB培养液， 37℃培养过夜， 次日按4%转接于含Amp的rich broth+glucose培养液(10 g蛋白胨， 5 g酵母提取物， 5 g氯化钠， 2 g葡萄糖)， 37℃振荡培养2 h， 加入IPTG至终浓度1 mmol/L诱导表达， 37℃振荡培养3 h。取菌体， 做120 g/L SDSPAGE， 用考马斯亮蓝染色观察。

　　1.2.3 MBPhEra的纯化 ①裂菌: 9000 r/min离心10 min收集400 mL诱导菌液的菌体， 加入22.8 mL column buffer (20 mmol/L Tris·HCl， 200 mmol/L NaCl， 1 mmol/L EDTA， 1 mmol/L Azide， 10 mmol/L βME) 悬浮沉淀， 取12 mL置冰水浴中进行超声裂解（150 W， 5 s， 5次）， 其余样品-20℃保存。 ②样品准备: 裂解物12000 r/min离心20 min， 上清用column buffer按1∶5体积比进行稀释。再离心1次去沉淀。 ③可溶蛋白的亲和层析: 将样品上直链淀粉树脂亲和层析柱， 用12倍柱体积的column buffer洗涤， 再用含10 mmol/L麦芽糖的column buffer洗脱。 ④亲和层析柱的再生: 依次用去离子水、 1g/L SDS、 去离子水、 column buffer洗柱。 在UV=280nm监测下， 收集每个吸收峰并走SDSPAGE。

　　1.2.4 MBPhEra融合蛋白的蛋白酶切割 取1 g/L的融合蛋白20 μL， 加入因子Xa1 μL至终浓度为200 mg/L(同时以5 μL不加因子Xa的融合蛋白作为对照)， 放置于室温。分别于2、 4、 8及24 h取5 μL反应液， 各加入2×加样缓冲液5 μL， 置于4℃保存。 然后走SDSPAGE观察酶切结果。 MBP和切下的hEra蛋白可以通过离子交换色谱或其他方法得到分离。

　　1.2.5 hEra的活性检测 ①GTP结合活性分析: 取hEra融合蛋白5 μL×4管(蛋白浓度为2.5、 0.25、 0.025及0.0025 g/L) (2.5 g/L BSA和2.5 g/L MBP作对照)， 分别加入Cocktail (50 mmol/L Tris·HCl， pH7.5， 5 mmol/L MgCl2 1 g/L NP40， 20 μmol/L GTP， 20 μmol/L ATP， 0.1 g/L BSA， 0.0054 Ci/L α32PGTP) 5 μL， 混合， 37℃水浴10 min。各取5 μL点于硝酸纤维素膜上， 1×binding buffer渍洗10 min， 共4次。将膜晾干。压膜， 磷屏扫描并分析结果。 根据各参数可以计算得到hEra蛋白与GTP结合的解离常数KD。②GTP酶活性分析: 取2.5 g/L hEra融合蛋白5 μL×5管(2.5 g/L BSA和2.5 g/L MBP作对照)， 分别加入Cocktail (50 mmol/L Tris·HCl， pH7.5， 5 mmol/L MgCl2 0.1 mmol/L DTT， 0.8 μmol/L GTP， 5 mmol/L ATP， 0.0054 Ci/L α32PGTP) 5 μL混合， 放置37℃中水浴， 在1、 3、 5、 7 h以后各取一管hEra融合蛋白混合液， 4℃保存。9 h以后取出全部样品混合液， 4℃保存。样品混合液各取1 μL分别点于饱和过的PEI celluloseF薄层层析片上， 室温在0.5 mmol/L Kh3PO4 1 mol/L NaCl展开液驱动下进行薄层层析。待展开液走到离层析片上缘约1 cm处， 取出层析片并晾干。压膜， 磷屏扫描并分析实验结果。根据各反应参数可以计算得到hEra蛋白GTP酶的Km值以及催化GTP水解的最大反应速度。

　　2 结果

　　2.1 pMALhEra的酶切鉴定 hera基因5′端有一个EcoR I切点， pMALp2x多克隆位点上有一个Pst I切点， EcoR I和Pst I双酶切应切下991 bp的片段（图1）。

　　图1 pMALhEra的酶切鉴定结果（略）

　　Fig 1 AGE analysis of recombinant plasmid pMALhEra digested with restriction endonuclease

　　M: 1 kb+100 bp ladder， 1， 2: pMALhEra(digested with EcoR I and Pst I).

　　2.2 pMALhEra的诱导表达 含pMALhEra质粒的TB1菌株， 于LB培养液内37℃培养过夜， 次日转接于rich broth+glucose培养液， 加IPTG诱导表达。由120 g/L SDSPAGE结果可以看出: 与未诱导的对照菌相比诱导菌在Mr 78000处有明显的新生蛋白表达带出现(图2， 箭头所示)， 大小和MBPhEra融合蛋白相符。激光薄层扫描结果表明:　　表达蛋白占菌体总蛋白的23.9%。

　　图2 pMALhEra在大肠杆菌中诱导表达的SDSPAGE结果（略）

　　Fig 2 SDSPAGE of induced E.coli with recombinant plasmid pMALhEra

　　M: Protein marker; 1: Noninduced TB1 bacteria with pMALhEra; 2: Induced TB1 bacteria with pMALhEra.

　　2.3 MBPhEra融合蛋白的纯化 在大肠杆菌TB1中诱导表达的MBPhEra融合蛋白主要以可溶形式存在。 用直链淀粉树脂 亲和色谱柱纯化此融合蛋白， 在280 nm监测下， 观察蛋白的流出情况（图3）。收集每个吸收峰并走120 g/L SDSPAGE， 激光薄层扫描结果表明， 用直链淀粉树脂亲和色谱柱纯化的融合蛋白纯度达到了87%（图4）。

　　图3 MBPhEra融合蛋白纯化的紫外监测结果（略）

　　Fig 3 Recording of the purification of the MBPhEra fusion protein by UV monitoring

　　A: Flowthrough; B: Wash with column buffer; C: Elute with column buffer(10 mmol/L maltose); D: Wash with deionized water; E: Wash with 1 g/L SDS.

　　图4 MBPhEra融合蛋白纯化的SDSPAGE结果（略）

　　Fig 4 SDSPAGE of the purified MBPhEra fusion protein

　　M: Protein marker; 1: Induced TB1 bacteria with pMALhEra; 2: Lysis of the bacteria; 3: Supernatant of the bacteria lysis; 4: Flowthrough; 5: Elute with column buffer(10 mmol/L maltose); 6: Wash with deionized water; 7: Wash with 1 g/L SDS.

　　MBPhEra融合蛋白与因子Xa分别作用2、 4、 8及24 h。取反应液走100 g/L SDSPAGE。从结果可以看出（图5）: 2 h和4 h时融合蛋白大部分已被切割， 8 h以后被全部切割。于Mr 42000处可以看到被切下的MBP蛋白条带， 于Mr 38000处可以看到被切下的hEra蛋白条带。但是切除后的hEra蛋白不稳定， 随着时间的延长而被降解。

　　2.4 GTP结合实验 取2.5 g/L MBPhEra融合蛋白分别作1、 10、 100、 1000倍稀释， 取各稀释度溶液各5 μL (以2.5 g/L BSA和MBP为对照)， 加入Cocktail(含α32PGTP) 5 μL， 混合， 37℃水浴10 min。然后依次点于硝酸纤维素膜上， 用磷屏扫描观察结果（图6）。 从计算机点密度扫描的结果可以看出: 空白对照（RB）的点密度最低; 相同浓度的hEra融合蛋白要比BSA和MBP的点密度要高4～5倍; 相同体积的hEra融合蛋白随着浓度的升高点密度加大（具体数值未列出）。说明hEra融合蛋白有明显的GTP结合活性， 而融合部分（MBP）无此作用。

　　图5 MBPhEra融合蛋白的蛋白酶切结果（略）

　　Fig 5 The MBPhEra fusion protein digested with Factor Xa

　　M: Protein marker; 1: Fusion protein eluted with the maltose; 2: Negative control（without Factor Xa）; 3-6: Fusion protein digested with Factor Xa for 2 h， 4 h， 8 h and 24 h.

　　图6 hEra融合蛋白与GTP结合的实验结果（略）

　　Fig 6 Binding test of hEra fusion protein and GTP

　　2.5 GTPase活性实验 取2.5 g/L MBPhEra融合蛋白(以2.5 g/L BSA和MBP为对照) 5 μL×5管， 加入Cocktail (含α32PGTP) 5 μL， 混合， 37℃水浴。作用1、 3、 5、 7及9 h的样品混合液（对照组均为9 h）各取1 μL进行薄层层析。从磷屏扫描结果可以看出: 同时作用9 h情况下， hEra融合蛋白能将GTP水解为GDP， 而BSA、 MBP及空白对照均不能（图7）。实验组GDP相应位置的计算机灰度扫描结果表明， 随着作用时间的延长， 底物（GTP）的量逐渐减少， 而反应产物（GDP）的量逐渐增多。由此说明: hEra融合蛋白有明显的GTPase活性， 而融合部分（MBP）无此活性。

　　图7 GTPase活性实验的薄层层析结果（略）

　　Fig 7 The GTPase activity assay by thin layer chromotography

　　1: Control; 2: BSA; 3: MBP; 4: 1 h; 5: 3 h; 6: 5 h; 7: 7 h; 8: 9 h.

　　3 讨论
　　
　　pMALp2x是一个融合表达载体， 它也受PT7强启动子的调控， 另外融合蛋白中的 MBP可以与直链淀粉树脂亲和结合， 因而表达蛋白的分离纯化十分方便， 同时MBP前的信号肽可以将融合蛋白分泌到细菌周质， 此过程有利于蛋白质的正确折叠及二硫键的形成， 从而增加了蛋白质的可溶性。利用此载体表达的hEra融合蛋白绝大部分位于上清中， 其表达量占菌体总蛋白的23.9%。利用pMALp2x载体表达的融合蛋白均是以可溶状态存在， MBP能和直链淀粉亲和层析柱相结合， 再用含麦芽糖的column buffer将融合蛋白洗脱下来， 而使MBPhEra融合蛋白得以纯化。接着用因子X将融合部分切除， 但切除后的人Era蛋白不稳定， 随着时间的延长而被降解。重复多次得到了同样的结果， 这可能是因为Era蛋白本身不稳定， 或是受到了污染的蛋白酶的攻击。
　　
　　era是从细菌到人高度保守的小G蛋白基因， hEra蛋白与eEra蛋白的氨基酸序列有31%相同， 两者的相似性为53%。eEra的N端含有4个鸟苷酸结合区（G1， G2， G3， G4）。高表达的eEra蛋白特性显示: Era是一种G蛋白， 能特异地与鸟苷酸结合， 并具有GTP酶的活性。本实验的研究结果证明hEra蛋白也能与GTP结合， 并具有GTP酶的活性。这对人era基因的功能研究具有重要意义。

参考文献

　　[1] Ahnn J， March PE， Takiff HE， et al. A GTPbinding protein of Escherichia coli has homology to yeast RAS proteins[J]. Proc Natl Acad Sci， 1986， 83(3): 8849-8853.

　　[2] Hang JQ， Zhao G. Characterization of the 16S rRNA and membranebinding domains of Streptococcus pneumoniae Era GTPase: Structural and functional implications[J]. Eut J Biochem， 2003， 270(20): 4164-4172.

　　[3] Sharma MR， Barat C， Wilson DN， et al. Interaction of Era with the 30S ribosomal subunit implications for 30S subunit assembly[J]. Mol Cell， 2005， 18(3): 319-29.

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　　[5] Akiyama T， Gohda J， Shibata S， et al. Mammalian homologue of E.coli Raslike GTPase (ERA) is a possible apoptosis regulator with RNA binding activity[J]. Genes Cells， 2001， 6(11): 987-1001.

　　[6] 萨姆布鲁克 J， 弗里奇 EF， 曼尼阿蒂斯 T(金冬雁， 等译). 分子克隆实验指南[M]. 2版. 北京: 科学出版社， 1996: 582-583.