抗人乙酰胆碱受体单链抗体1956#在大肠杆菌中的可溶性表达

　　　　 作者：宋琛， 徐江， 张芳琳， 白文涛， 李柱一

【摘要】 　　目的: 重组表达抗人乙酰胆碱受体（AChR）单链抗体（scFv）1956#， 提高scFv1956#的可溶性表达量。方法: 用PCR扩增含抗人AChR scFv1956#的载体pHEN1中的scFv1956#结构基因， 并将其插入到原核表达载体pET44a（+）。用重新构建的载体转化E.coli BL21(DE3)pLysS， IPTG诱导表达。用SDSPAGE来比较更换载体及不同温度和时间对可溶性表达量的影响， 并通过Western blot进行鉴定。结果: PCR产物大小为785 bp， 与预计相符; 所构建质粒经测序证实scFv1956#核苷酸序列正确， 并正确插入载体pET44a(+)。诱导后得到的可溶性表达量优于原载体pHEN1。结论: 载体pET44a（+）表达的端融蛋白NusA可以帮助scFv1956#的正确折叠， 从而获得大量可溶性表达。低温长时间诱导有助于提高可溶性表达的量。

【关键词】 重症肌无力 乙酰胆碱受体 单链抗体 NusA

　　重症肌无力(myasthenia gravis， MG)是由乙酰胆碱受体抗体(AChR Ab)介导， 并有补体参与的自身免疫性疾病[1]。神经肌肉接头(neuromuscular junction， NMJ)处， 位于突触后膜的乙酰胆碱受体（AchR）受到自身抗体AchR Ab攻击: 一方面， 二价的AchR Ab与AchR的α亚单位结合后与其交联， 拉近AchR， 加速受体内化、 降解[2]（抗原调变作用antigen modulation， AM）; 另一方面， AchR Ab的Fc段可以激活补体系统， 使大量的补体沉积于NMJ处， 溶解、 破坏突触后膜和AchR， 导致突触后膜萎缩[3]。在AChR Ab这两方面的作用下， AchR丢失， 乙酰胆碱(ACh)传递障碍， NMJ处化学电冲动解偶联， 从而引起NMJ传递障碍， 表现为肌无力。
　　
　　抗AChR的单链抗体(scFv)是由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)经Linker(Gly4Ser)3连接而成， 在较好保留了亲代单克隆抗体（mAb）亲和活性的基础上: 由于是单价抗体， 不会引起AChR分子交连后的抗原调变作用[4]; 由于缺乏Fc段， 也不会激活补体， 攻击突触后膜。同时， 通过占位效应， 它可以起到保护AChR免受MG患者血清中自身抗体攻击的作用[5]。抗AChR的scFv1956#的亲代mAb195对人AChR有高度亲和力， 是理想的研究靶点[6]。本研究中拟采用原核表达载体pET44a(+)融合表达scFv1956#， 以期获得大量可溶性蛋白， 为scFv1956#的进一步应用提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 含抗人乙酰胆碱受体scFv1956#的载体pHEN1由希腊巴斯德研究所Socrates J. Tzartos先生惠赠， pET44a(+)载体由第四军医大学免疫学教研室杨安钢教授惠赠。菌株BL21(DE3)pLysS和HB2151分别由唐都医院传染科及基础部病原生物学教研室惠赠。Pyrobest高保真DNA聚合酶， 限制性内切酶Sma I、 Xho I， T4 DNA连接酶， DL 2000 DNA Marker均购自TaKaRa公司， 质粒小提试剂盒、 DNA回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。IPTG、 βmercaptoethanol购自北京鼎国生物技术公司。HRP标记羊抗小鼠二抗购自cell signaling公司， 抗cMyc（9E10）购自santa cruz biotechnology 公司。引物合成及所构建载体的测序均由北京奥科生物技术公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 pHEN1scFv1956#的表达及分析 以原表达载体pHEN1scFv1956# 1 μL转化100 μL表达宿主HB2151感受态菌， 转化产物涂布含100 mg/L Amp的2×YT琼脂平板， 37℃孵育12 h。随意挑取1个阳性转化子接种于5 mL含100 mg/L Amp的2×YT培养基中， 37℃， 用260 r/min震摇12 h后 （A600≈1）， 分别取100 μL菌液转接至2管5 mL含100 mg/L Amp的2×YT培养基， 继续培养至A600≈0.6（约3 h）， 加入1 mmol/L IPTG分别用两组不同温度和时间条件诱导（37℃诱导4 h， 25℃诱导20 h ）。诱导前预留0.5 mL菌液， 诱导后取1 mL菌液， 13000 r/min， 5 min集菌; 剩余3.5 mL菌液4℃， 13000 r/min， 5 min离心集菌， 取100 μL上清转移至一新离心管中， 加入100 μL2×loading buffer; 取1 mL上清， 用三氯乙酸(TCA)沉淀[7]后加入200 μL2×loading buffer（浓缩5倍）; 菌体用渗透压休克法[8]得到胞周质成分， 取1 mL胞周质成分TCA沉淀后加入200 μL2×loading buffer。向诱导前、 后的菌体中加入200 μL2×loading buffer和200 μL去离子水。所制样品煮沸变性5 min后SDSPAGE分析。

　　1.2.2 pET44a表达载体的构建 根据scFv1956#的结构基因， 设计引物44aup: 5′TC CCC CGG GGC AGC CAG GTC CAA TTT GTA G3′， 44adown: 5′CCG CTC GAG TTA ATT CAG ATC CTC TTC T3′（下划线分别为Sma I和Xho I的酶切位点）。以含抗人AChR scFv1956# 的质粒pHEN1为模板， 用Pyrobest高保真DNA聚合酶扩增所需克隆片段。PCR反应条件: 第1个循环， 94℃变性4 min， 52℃退火1 min， 72℃延伸1 min; 后28个循环: 94℃变性30 s， 60.6℃退火1 min， 72℃延伸1 min; 最后72℃延伸5 min， 4℃保存。乙醇沉淀法[9]回收PCR产物， 先后用Sma I（酶切温度30℃）、 Xho I酶切PCR回收产物和pET44a(+)载体， 8 g/L琼脂糖凝胶电泳后回收酶切后的PCR片段和pET44a(+)载体。T4 DNA连接酶16℃过夜（16 h）连接目的片段与载体， 取10 μL连接产物转化100 μL感受态JM109， 涂布100 mg/L氨苄青霉素(Amp) 2×YT琼脂平板。37℃孵育14 h后， 随意挑取5个阳性转化子， 接种至含100 mg/L Amp的2×YT培养基， 37℃， 260 r/min震摇12h后取菌液1.5mL小量提取质粒后， SmaI、 XhoI双酶切鉴定目的片段的存在。从5个酶切鉴定的阳性克隆中随机挑选1个克隆（以pET44ascFv1956#命名）， 送北京奥科生物技术公司测序。测序结果证明scFv1956#已经正确插入到pET44a(+)载体， 无点突变和读码框移。

　　1.2.3 pET44ascFv1956#的表达及分析 将构建好的表达载体pET44ascFv1956# 1 μL转化100 μL原核表达宿主BL21(DE3)pLysS感受态菌， 转化产物涂布于含100 mg/L氯霉素(Cam)、 100 mg/L Amp的2×YT琼脂平板上， 37℃孵育10 h。随意挑取2个阳性转化子接种于5 mL含100 mg/L Cam和100 mg/L Amp的2×YT培养基， 37℃、 260 r/min震摇5 h后 （A600≈0.6）， 加入1 mmol/L IPTG分别用两组不同温度和时间条件诱导（37℃诱导4 h， 25℃诱导20 h）。诱导前预留0.5 mL菌液， 诱导后取1 mL菌液， 13000 r/min， 5 min集菌; 剩余3.5mL菌液4℃ 13000r/min， 5min离心集菌， 菌体用200μL含1 mmol/L EDTA、 20 mmol/L PBS(pH7)、 0.5 mol/L NaCl的裂菌液重悬后， 冰浴中超声裂菌约20次， 每次5 s， 间隔20 s， 至菌液清亮不黏稠。于4℃ 13000 r/min离心15 min， 取100 μL上清转移至离心管中， 加入100 μL2×loading buffer， 向菌体及裂菌后沉淀中加150 μL2×loading buffer和150 μL去离子水， 煮沸变性5 min后SDSPAGE分析。

　　1.2.4 表达产物的鉴定及比较 Western blot鉴定比较两种不同载体、 菌株和不同诱导时间、 温度条件下， scFv1956#可溶性表达产物量的变化。SDSPAGE结束后， 使用BIORAD公司的Transblot SD半干转印槽， 将凝胶、 硝酸纤维膜夹放在两层滤纸之间（凝胶位于阴极一侧）， 15 V恒压 40 min（pET44ascFv1956#由于带端融蛋白NusA需延长至50 min）， 将蛋白从凝胶电转移至硝酸纤维膜上。电转移结束后， 取出硝酸纤维膜， 用丽春红染液染膜30 s， 去离子水漂洗， 条带显色时用2B铅笔标记蛋白Marker的位置。封闭液（含50 g/L脱脂奶粉的TBST）室温孵育3 h， 加入1∶500稀释的抗cMyc (9E10) 4℃孵育过夜， TBST室温洗膜4次（10 min/次）后加入以1∶10000稀释的HRP标记羊抗小鼠二抗室温孵育1 h， TBST室温洗膜4次（10 min/次）， 加入化学发光底物West Pico chemiluminescent（PIERCE）室温放置5 min后暗室压片。

　　2 结果

　　2.1 scFv1956# 融合蛋白表达载体的鉴定 根据所设计的引物进行PCR， 得到的片段大小为780 bp(图1)， 与预期一致。得到的亚克隆所提质粒pET44ascFv1956# 经Sma I、 Xho I双酶切鉴定(图2)均为阳性。测序结果证实scFv1956# 已成功插入到pET44a(+)载体中， 且与希腊巴斯德研究所制备的抗AChR的scFv1956# 核酸序列完全一致， 并未出现点突变或读码框移(北京奥科生物技术有限责任公司)。

　　图1 PCR产物scFv1956#的琼脂糖电泳鉴定（略）

　　1: PCR产物; 2: DNA marker.

　　图2 pET44ascFv1956#表达载体的酶切鉴定（略）

　　1: Sma I、 Xho I双酶切产物; 2: DNA marker.

　　2.2 表达产物的SDSPAGE分析 根据Bioedit软件的计算结果， pHEN1scFv1956#表达产物的相对分子质量（Mr）为28108， 而融合了NusA（N utilization substance protein A）蛋白的pET44ascFv1956#表达产物的Mr为87072。在1 mmol/L IPTG条件下， 无论是37℃诱导 4 h， 还是25℃诱导20 h， pHEN1scFv1956#的表达产物SDSPAGE后CBBR250染色， 与诱导前相比并未发现明显新生条带（图3）。而改用载体pET44a(+)后， 同样用1 mmol/L IPTG， 37℃诱导4 h的产物与诱导前相比在Mr为90000附近出现新生条带， 与目的蛋白大小相符， 多为不溶的包涵体， 有部分可溶性表达， 而在25℃诱导20 h后的产物， 明显可见裂菌后上清中的可溶性产物量增多（图4）。

　　2.3 表达产物特异性鉴定 用菌株HB2151表达pHEN1scFv1956#， 电转后的硝酸纤维膜作Western blot分析， 压片可见菌体成分出现Mr大小约28000特异蛋白带（诱导前菌体亦出现此条带）， 诱导后用TCA沉淀法浓缩5倍的上清及细胞周质成分均无条带出现(图5)。而用菌株BL21(DE3)pLysS表达pET44ascFv1956#， Western blot结果显示在Mr为90000附近， 诱导后菌体、 裂菌后的上清、 沉淀， 均出现特异蛋白带， 且25℃诱导20 h组上清的可溶性表达量明显优于37℃诱导4 h组（图6）。

　　图3 pHEN1scFv1956#转化表达宿主HB2151 IPTG诱导前后的SDSPAGE分析（略）

　　1: 蛋白marker; 2， 3: 质粒转化大肠杆菌HB2151 IPTG诱导前上清和菌体成分; 4-7: 37℃诱导4 h后的上清、 TCA沉淀法浓缩后的上清及胞周质蛋白成分、 菌体成分; 8， 9: 25℃诱导20 h后TCA沉淀法浓缩后的上清和胞周质蛋白成分.

　　图4 pET44ascFv1956#转化表达宿主BL21(DE3)pLysS IPTG诱导前后的SDSPAGE分析（略）

　　1: 蛋白marker; 2: 重组质粒转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS IPTG诱导前菌体成分; 3-5: 37℃诱导4 h后的菌体蛋白、 可溶和不可溶的菌体蛋白成分; 6-8: 25℃诱导20 h后的菌体蛋白、 可溶和不可溶的菌体蛋白成分.

　　图5 HB2151表达pHEN1scFv1956#的Western blot检测（略）

　　1: 诱导前菌体成分; 2-4: 37℃诱导4 h后TCA沉淀法浓缩后的上清及胞周质蛋白成分， 菌体蛋白成分; 5-7: 25℃诱导20 h后的TCA沉淀法浓缩后的上清及胞周质蛋白成分， 菌体蛋白成分.

　　图6 BL21(DE3)pLysS表达pET44ascFv1956#的Western blot检测（略）

　　1: IPTG诱导前菌体成分; 2， 3: 37℃诱导4 h后可溶和不可溶的菌体蛋白成分; 4， 5: 25℃诱导20 h后可溶和不可溶的菌体蛋白成分.

　　3 讨论
　　
　　重组的scFv可以保护AChR免受其亲代mAb或MG患者血清中自身抗体的攻击[10]， 因而成为MG治疗最有潜力的靶点。而如何能在E.coli这一生物工厂中生产出大量具有生物和免疫活性的scFv仍是目前面临的主要问题。本研究比较两种不同表达形式， 使用了表达载体pET44a(+)在E.coli中获得融合蛋白scFv1956#较大量的可溶性表达， 对于其功能鉴定及其将来在分子水平治疗MG具有重要意义。
　　
　　scFv的表达主要有3种形式: ①直接在细胞质中表达， 其结果往往是表达产物在细胞质内形成不溶性的包涵体(Inclusion body); ②与其他菌体蛋白（如: NusA）融合， 表达可溶性的融合蛋白; ③将scFv基因与引导分泌的信号肽基因（如: phoA）相连接， 使表达产物分泌至E.coli的细胞外周质(periplasm)或培养上清中。本研究选择后两种表达形式直接获取可溶性目的蛋白， 并对两种表达形式进行比较。原有载体pHEN1在scFv1956#的结构基因后带有M13噬菌体外壳蛋白基因（fd phage gene III）， 二者的相接处设计了一个琥珀密码子(TAG)， 在含有琥珀突变的宿主菌中， TAG可翻译为某种氨基酸而不起终止密码子的作用， 表达出的scFv为融合了Gene III的融合蛋白， 能够在辅助噬菌体辅助下组装成噬菌体颗粒， 用于构建噬菌体呈现文库; 在无琥珀突变的宿主菌中（如: HB2151）TAG成为终止密码子， scFv1956#会随其结构基因前所带的分泌表达信号肽PelB分泌到E.coli细胞膜与细胞壁之间的胞周质或培养上清。然而转化到表达宿主HB2151的pHEN1scFv1956#并未得到预想结果: 从SDSPAGE上看， 无论37℃诱导4 h还是25℃诱导20 h， 上清、 胞周质乃至菌体中均未见目的蛋白大小处有浓集。利用融合在scFv1956#羧基端的CMYC标签， 做Western blot检测其表达量及其定位， 大多scFv是以包涵体的形式定位于菌体中; 用TCA沉淀的方法分别5倍浓缩位于上清和细胞周质的蛋白后做Western blot检测， 均未见目标条带。结果表明低温， 长时间诱导并不能促进scFv1956#的分泌性表达， 排除了由于scFv1956#的过量表达， 或分泌系统超载所致的目的蛋白未分泌表达。可能表达产物scFv1956#的转运及正常折叠还需要分子伴侣的参与及其他分子的辅助。Western blot的结果表明诱导前的菌体中也有目的蛋白的表达， 可能与lac操纵子阻遏蛋白的抑制不完全，有渗漏相关。
　　
　　改建的载体pET44ascFv1956#保留了融合在scFv1956#羧基端的CMYC标签用于鉴定， 在其氨基端融合了NusA蛋白， 同时带有2个His标签便于用Ni2+螯合柱进行纯化。NusA蛋白是从SwissProt蛋白库的4000多种E.coli菌体蛋白中筛选出的蛋白， 可以提高与其融合蛋白的可溶性， 位于其后的凝血酶（Thrombin）识别位点可以便于下一步纯化后将scFv1956#从NusA上切除。优化诱导表达的条件: 用1 mmol/L IPTG分别用37℃诱导4 h及25℃诱导20 h， SDSPAGE和Western blot结果表明， 低温诱导能明显提高可溶性融合蛋白的产量， 可能与低温条件下蛋白合成速率降低， 有利于蛋白的正确折叠和二硫键的形成相关; 而延长诱导时间， 菌体量的增加使得目的蛋白获得量增多。大量可溶性目的蛋白的获得， 为下一步分离纯化目标蛋白及其功能鉴定具有重要的意义。

　　致谢: 感谢希腊巴斯德研究所的Socrates J. Tzartos先生， 第四军医大学基础部免疫学教研室杨琨副教授对本研究的热心支持和帮助。

参考文献

　　[1] Vincent A. Unravelling the pathogenesis of myasthenia gravis[J]. Nature Rev Immunol， 2002， 2（10）: 797-804.

　　[2] De Baets M， Stassen MH. The role of antibodies in myasthenia gravis[J]. J Neurol Sci， 2002， 202（1-2）: 5-11.

　　[3] Tuzun E， Scott BG， Goluszko E， et al. Genetic evidence for involvement of classical complement pathway in induction of experimental autoimmune myashenia gravis[J]. J Immunol， 2003， 171（7）: 3847-3854.

　　[4] Fostieri E， Tzartos SJ. Isolation of potent human Fab fragments against a novel highly immunogenic region on human muscle acetylcholine receptor which protect the receptor from myasthenic autoantibodies[J]. Eur J Immunol， 2005， 35（2）: 632-643.

　　[5] Papanastasiou D， Mamalaki A， Tzartos SJ， et al. Construction and characterization of a humanized single chain Fv antibody fragment against the main immunogenic region of the acetylcholine receptor[J]. J Neuroimmunology， 1999， 94（1-2）: 182-195.

　　[6] Tsantili P， Tzartos SJ， Mamalaki A. High affinity singlechain antibody fragments protecting the human nicotinic acetylcholine receptor[J]. J Neuroimmunol， 1999， 94（1-2）: 15-27.

　　[7] 马歇克 DR， 门永 JT， 布格斯 RR， 等（朱厚础， 等译）. 蛋白质纯化与鉴定实验指南[M]. 北京: 科学出版社， 1996: 259-261.

　　[8] Novagen pET. System Manual[M]. The 11 th edition. Novagen， 2003: 19-20.

　　[9] 萨姆布鲁克 J， 拉塞尔 DW（黄培堂， 等译）. 分子克隆试验指南[M]. 3版. 北京: 科学出版社， 2002: 38-39.

　　[10] Mamalaki A， Trakas N， Tzartos SJ. Bacterial expression of a singlechain Fv fragment which efficiently protects the acetylcholine receptor against antigenic modulation caused by myasthenic antibodies[J]. Eur J Immunol， 1993， 23（8）: 1839-1845.