新型自杀基因linamarase/linamarin系统对人肝癌细胞HepG2体外杀伤效应及其旁观

　　 作者：陈明浩， 马俊， 李海民*， 李军， 李韧， 张福琴， 窦科锋

【摘要】 　　目的: 研究新型自杀基因亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙（lis/lin）统对人肝癌细胞HepG2的体外杀伤效应。方法: 应用分子克隆技术构建热带植物木薯的cDNA文库， 并从中扩增出lin基因克隆至pEGFPN1载体， 构建质粒pEGFPN1lis。通过电穿孔法将其转染人肝癌细胞株HepG2， 同时进行G418筛选， 直至出现抗性克隆， 扩大培养， 命名为HepG2/lis， 通过荧光显微镜观察、 RTPCR、 Western blot鉴定lis基因的表达; 采用MTT法观察不同浓度lin对已转染的HepG2的杀伤作用及旁观者效应。结果: RTPCR和Western blot证明转染的lis基因能够在HepG2细胞中表达并产生融合蛋白lisEGFP; 低浓度lin对转染了lis基因的HepG2细胞具有明显的细胞毒效应; 旁观者效应显示仅10%左右的HepG2/lis细胞与90%的HepG2细胞混合培养于lin浓度为500 mg/L的培养基时， 就可显示出明显的旁观者效应。结论: lis/lin自杀基因系统在lin浓度为500 mg/L时对人原发性肝癌细胞HepG2具有明显的杀伤作用和旁观者效应。

【关键词】 人肝癌细胞 HepG2 自杀基因 旁观者效应

　　[Abstract] AIM: To investigate the killing effect of linamarase/linamarin (lis/lin) system on hepatocellular carcinoma cell line HepG2 in vitro. METHODS: A cDNA library was built from RNA of cassava by RTPCR， then the linamarase gene was amplified from it by PCR and cloned into the eukaryotic expression vector plasmid pEGFPN1， which made up the recombinant plasmid pEGFPN1lis. The human HCC cells HepG2 were transfected with the recombinant plasmid mediated by electroporation and screened by G418 to yield the positive clone which was termed HepG2/lis. The expression of lis was confirmed by fluorescent staining， RTPCR and Western blot. The killing effect and bystander effect of linamarin with different concentrations on HepG2 was detected by MTT. RESULTS: RTPCR confirmed the expression of lis gene in HepG2 and Western blot analysis confirmed existence of lisEGFP fusion protein in HepG2. Linamarin in low concentration had shown notable cytotoxic effect on HepG2/lis. When HepG2/lis cells were mixed with parental HepG2 cells at a ratio of 10∶90 and cultivated in 500 mg/L lin medium， significant bystander effect was observed in vitro. CONCLUSION: The linamarase/linamarin suicide gene system has strong killing effect and bystander effect on HCCs with the concentration of 500 mg/L lin.

　　[Keywords]hepatocellular carcinoma cell; HepG2; suicide gene; bystander effect

　　我国是肝癌的高发区， 目前肝癌的治疗主要以手术切除为主， 但仍缺乏其他有效的治疗手段。近十余年来， 随着分子生物学技术的发展， 基因治疗的问世开辟了肝癌治疗的新途径， 其中以肿瘤的自杀基因疗法最为引人注目。将自杀基因导入肿瘤细胞后， 自杀基因的编码产物可以在体内将无毒性的前体药物转化为有毒性药物， 从而对转染的肿瘤细胞起到杀伤作用， 同时还可对肿瘤细胞邻近的未转染分裂细胞通过旁观者效应(bystander effect)起作用。通过转入自杀基因而赋予肿瘤细胞新的表型而引起药物对肿瘤细胞直接或间接杀伤作用的疗法称为自杀基因疗法。
　　
　　源自热带植物木薯的亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙（linamarase/linamarin， lis/lin）系统是一种新型自杀基因系统， 一些文献研究报道， 相比较以往自杀基因系统， lis/lin系统具有更高的杀伤效率以及更为强大的旁观者效应[1]， 成为自杀基因研究的新方向。本研究旨在从木薯中提取lis基因Cas5， 构建lis/lin自杀基因系统， 并对其体外杀伤效应及旁观者效应进行初步的研究， 为后续的实验打下基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 木薯嫩芽（购自广西玉林）。大肠杆菌DH5α（本室传代冻存）， 人肝癌细胞系HepG2(本室保存) ， 质粒pEGFPN1（西京医院肝胆外科李韧博士惠赠）。植物RNA提取试剂盒RNAplant、 PCR试剂盒Tag Plus Mix（TIANGEN公司）; RTPCR试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司）; 琼脂糖、 DNA胶回收试剂盒（上海生工公司）; T4连接酶、 内切酶Xhol I、 Sal I（TaKaRa公司）; 质粒提取纯化试剂盒（OMEGA公司）; 高糖DMEM无血清培养基、 新生牛血清（Gibco公司）; 前体药物亚麻苦甙（linamarin， lin）为International Laboratory USA产品; G418、 丁胺卡那霉素、 MTT（Invitrogen公司）; 低渗电穿孔缓冲液lipofectin（eppendorf 公司）; 其余试剂均为进口分装或国产分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 根据NCBI上报的木薯linamarase全长cDNA序列， 设计上游引物5′ACTCTCGAGATGCTCGTCTTGTTCATAAG3′， 下游引物5′CGAGTCGACAACATCACATAGAATTTGC3′， 其中上游引物含有Xho I酶切位点， 下游引物含有Sal I酶切位点（下划线即为酶切位点）。设计下游引物时将lis全长cDNA的3′端的终止密码子删除并使其阅读框与下游的EGFP基因一致。引物由北京奥科生物科学技术有限公司合成， 预计扩增长度为1.6 kb。

　　1.2.2 木薯cDNA文库的构建 摘取新鲜木薯嫩芽， 液氮中碾磨破碎细胞壁， 按TIANGEN公司的植物RNA提取试剂盒RNAplant说明书进行总RNA提取。植物总RNA溶液260 nm及280 nm测定A值， 鉴定RNA的量和纯度， 并行核酸电泳鉴定总RNA完整度。以该总RNA为模板， 按Feminegon RTPCR试剂盒说明进行反转录反应， 构建木薯cDNA文库。

　　1.2.3 PCR扩增lis基因 以木薯cDNA文库为模板， 按照TIANGEN公司Tag Plus Mix试剂盒说明进行PCR反应， 按下列参数循环40次: 95℃变性30 s， 62.5℃退火30 s， 72℃延伸3 min， 10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析， 见1.6 kb处出现一条条带， 切下该条带所在凝胶， 按照凝胶回收试剂盒说明进行胶回收， 回收产物溶于40 μL水中。

　　1.2.4 重组pEGFPN1lis质粒的构建 将上述DNA产物用Xhol I 和Sal I进行双酶切， 10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析后切下lis基因所在凝胶， 按照凝胶回收试剂盒说明进行胶回收， 回收产物溶于40 μL水中。将载体pEGFPN1质粒（约4.7 kb大小）用Xhol I和Sal I双酶切后与酶切回收后的lis基因在16℃条件下进行连接， 电穿孔法转化至大肠杆菌DH5α， 涂布含丁胺卡那霉素的琼脂糖平板后， 37℃过夜培养。挑取单个菌落行扩增培养， OMEGA质粒试剂盒提取质粒后， 用Xhol I、 Sal I分别进行单酶切及双酶切， 10 g/L琼脂凝胶电泳分析， 同时将构建好的质粒送检测序（由北京奥科生物科学技术有限公司测序）。

　　1.2.5 整合lisEGFP基因及EGFP基因单克隆细胞的筛选 电穿孔法分别将重组pEGFPN1lis质粒和pEGFPN1质粒转染入HepG2细胞中， 穿孔后把细胞移入6孔板中加入含血清的DMEM培养基。37℃温育48 h后， 换含有600 mg/L G418培养基进行压力筛选， 直至抗性克隆出现， 挑选含荧光的抗性克隆进行扩增， 筛选后阳性克隆细胞分别命名为HepG2/lis和HepG2/EGFP。利用RTPCR鉴定HepG2/lis细胞中lis基因的mRNA表达、 Western blot鉴定lisGFP融合蛋白的表达。

　　1.2.6 pEGFPN1lis系统的细胞毒性试验 将1×104的HepG2/lis、 HepG2/EGFP、 HepG2细胞分别接种于96孔培养板内作为实验组、 阴性对照组和空白对照组， 24 h后分别加入含有50、 100、 250、 500和1000 mg/L lin的含100 mL/L小牛血清的高糖DMEM培养基。分别于加药培养后的第2天和第4天用MTT法检测细胞的相对存活率: 每孔加入20 μL MTT（5g/L）， 37℃继续培养5h后， 吸弃上清， 每孔加入100μL DMSO， 37℃放置30 min， 使色素沉淀充分溶解后570 nm测定A值， 结果以相对存活率表示， 每种浓度同时进行6孔， 重复3次。

　　1.2.7 旁观者效应的观察 将总数为1×104的HepG2细胞与HepG2/lis以不同比例混合， 即100∶0， 95∶5， 90∶10， 70∶30， 0∶100， 接种于96孔板中， 第2天换含有250、 500和1000 mg/L lin的含100 mL/L小牛血清的高糖DMEM培养基继续培养， 分别培养2 d和4 d后， 用MTT法观察活细胞比例， 每种比例同时进行6孔， 重复3次。

　　2 结果

　　2.1 木薯总RNA的提取、 鉴定 在液氮中研磨木薯嫩芽， 利用RNAplant试剂盒提取木薯总RNA。分光光度法测定RNA纯度， 其A260/A280值为1.843; 凝胶电泳可见28 S、 18 S条带清晰无脱尾， 28 S条带亮度约为18 S条带的2倍， 5 S条带不明显（图1）。

　　2.2 lis基因PCR扩增及其产物电泳鉴定 以木薯总RNA为模板通过反转录构建木薯cDNA文库，然后通过PCR扩增出预期的大小约为1.6 kb的目的片段， 条带清晰， 无非特异性扩增现象（图2）。

　　图1 木薯RNA电泳鉴定（略）

　　Fig 1 RNA electrophoresis analysis of cassava

　　图2 lis基因PCR电泳鉴定（略）

　　Fig 2 Electrophoresis analysis of lis gene by PCR

　　M: DNA marker; 1: lis gene.

　　2.3 重组pEGFPN1lis质粒的酶切鉴定 通过XholI和SalI双酶切重组质粒， 分别切出4.7 kb和1.5 kb的片段， 大小与预期相符（图3）。进行克隆片段两端测序鉴定（测序为北京奥科公司）， 与文献报道的基因序列相同。以上结果表明， 重组质粒pEGfPN1lis构建正确。

　　图3 重组质粒pEGFPN1lis的酶切鉴定（略）

　　Fig 3 Restrictive engyme digestion analysis of recombinant vector pEGFPN1lis

　　M: DNA marker; 1: pEGFPN1lis+Xhol I+Sal I; 2: pEGFPN1lis+Xhol I; 3: pEGFPN1lis+Sal I; 4: pEGFPN1.

　　2.4 重组pEGFPN1lis质粒转染HepG2细胞后EGFP表达观察 电穿孔法转染细胞24 h后在488 nm激发光荧光显微镜下观察， 发现部分细胞发出绿色萤光（图4）。稳定转染后挑取lisEGFP单克隆阳性细胞扩增培养， 荧光显微镜下观察， 细胞绿色荧光明显， 提示细胞有稳定的的lisEGFP基因表达（图5）。

　　图4 瞬时转染24 h细胞（略）

　　Fig 4 Cells of transient transfection after 24 hours (×200)

　　图5 稳定转染阳性单克隆细胞（略）

　　Fig 5 Cells of stable transfection positive clone (×200)

　　2.5 RTPCR检测重组pEGFPN1lis质粒转染HepG2细胞后lisEGFP基因的表达 TRIzol法从培养的lisEGFP单克隆阳性细胞中提取总RNA， RTPCR法检测lis基因的mRNA表达情况。电泳结果显示经RTPCR扩增出大小约为1.6 kb的片段， 其大小与理论预期值相一致， 提示lis基因有mRNA表达; 而对照组未转染HepG2细胞中没有该条带。

　　2.6 Western blot检测重组pEGFPN1lis质粒转染HepG2细胞后lisEGFP蛋白的表达 破碎lisEGFP单克隆阳性细胞后取上清液， Western blot检测蛋白表达， 结果显示试验组重组蛋白Mr约为95000， 与预期融合蛋白大小相一致， 提示有融合蛋白lisEGFP蛋白的表达; 而对照组未转染HepG2细胞结果为阴性（图6）。
　　
　　图6 融合蛋白lisEGFP Western blot鉴定（略）

　　Fig 6 Western blot analysis of recombinant protein lisEGFP

　　1: HepG2/lis cells; 2: HepG2 cells.

　　2.7 重组pEGFPN1lis质粒对人肝癌细胞的细胞毒作用 通过MTT法检测细胞存活率显示， lis/lin自杀基因系统具有强烈的细胞作用。由图7A可见， 在给药48 h后， HepG2/lis细胞生存率随前体药物的浓度的增加而逐渐降低， 当前体药物浓度达到500～1000 mg/L时， 可观察到lis/lin自杀基因系统对其产生的明显的细胞毒作用。由图7B可见， 在给药96 h后， 随着毒性物质的积累， lis/lin对HepG2/lis细胞产生了更为明显的杀伤作用， 在lin浓度为250 mg/L时， 绝大部分细胞被杀伤， 在lin浓度大于500 mg/L时， 全部细胞被杀死。而作为阴性对照的HepG2/EGFP细胞组和空白对照的HepG2细胞组， 在48 h和96 h两个时间点上可以观察到不同浓度lin对其生存率都不产生任何影响。

　　图7 lis/lin自杀基因系统对HepG2细胞的杀伤效应（略）

　　Fig 7 Killing effect of lis/lin suicide gene system on HepG2 cells

　　A: Survival rate (%) of HepG2 cells treated with lin after 48 hours; B: Survival rate (%) of HepG2 cells treated with lin after 96 hours.

　　2.8 Lis/lin系统旁观者效应的观察 通过不同比例表达和不表达lis基因的HepG2细胞混合， 可以观察添加lin时， lis/lin系统的旁观者效应。由图8A可见在给药48 h后， 小于10%的混合比例的HepG2/lis细胞在不同浓度lin下所表现的旁观者效应并不明显; 而大于30%的混合比例时， 不同浓度lin下的细胞相对生存率同100% HepG2/lis细胞的细胞相对生存率相接近， 有明显的旁观者效应。由图8B可见在给药96 h后， 只需5%～10%的HepG2/lis细胞， 90%的细胞即可被杀死; 在HepG2/lis细胞混合比例大于30%、 lin浓度大于500 mg/L时， 全部细胞被杀死。这个结果提示， lis/lin系统具有强大旁观者效应。

　　图8 lis/lin自杀基因系统的旁观者效应（略）

　　Fig 8 Bystander effect of lis/lin suicide gene system

　　A: Survival rate (%) of cells treated with lin after 48 hours; B: Survival rate (%) of cells treated with lin after 96 hours.

　　3 讨论
　　
　　自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗的一个重要发展方向。目前， 研究多集中于单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷 (herps simplex virus thymidine kinase/ganciclovir， HSVTK/GCV) 和胞嘧啶脱氨酶/5氟胞嘧啶(cytosine deaminas/5flucytosine， CD/5FC) 这两个自杀基因系统， 此两系统的抗瘤效能已在多种肿瘤[2-5]的体内外实验中得到证实并进入临床试验。但是， 转染效率低下、 肿瘤细胞不敏感出现抗性[6]等问题成为制约自杀基因疗法进一步发展的阻力。Lis/lin自杀基因系统源于热带植物木薯体内存在的一种氰化物生成系统， lis是一种存在于木薯叶柄和根部中的β葡萄糖苷酶， 最适温度为55℃， 它可以水解无毒的底物lin， 生成丙酮氰醇和葡萄糖。丙酮氰醇在pH值大于6时不稳定， 可自发水解成丙酮和氰化物（CN-）。目前研究认为， lis/lin自杀基因系统的代谢产物CN对生物细胞具有强烈的杀伤能力［1］; 同时由于CN-能够在细胞膜间自由扩散， 因而使其表现出强大的旁观者效应。
　　
　　我们从木薯嫩芽中提取总RNA经反转录成功构建木薯cDNA文库， 并从中克隆出lis基因Cas5， 经测序验证正确连接于pEGFPN1载体， 构建融合基因lisEGFP， 观察了lis基因在肿瘤细胞中的表达情况， 对原发肝癌细胞HepG2进行了杀伤效应研究， 结果发现在较低浓度前体药物浓度下， 转染的lis基因对HepG2细胞可产生明显的杀伤效应。旁观者效应研究发现， 只需5%～10%左右的转染lis基因的细胞就可杀死90%的细胞， 而当这一比例达到30%时， 全部的细胞被杀死， 表明我们构建的lisEGFP基因具有良好的肿瘤杀伤作用， 为进一步和其他基因构建融合基因提供了良好的基础。而在未转染lis基因的阴性对照组和空白对照组中， 即使当lin浓度达到1000 mg/L时， 细胞生长没有受到任何影响， 说明lis/lin自杀基因系统是一种高效、 无毒的自杀基因系统， 为后续的体内试验研究提供里一个安全、 理想的试验平台。在本试验的旁观者效应研究过程中发现， 在给药的最初48 h， 小于10%的混合比例的HepG2/lis细胞在不同浓度lin下所表现的旁观者效应并不明显， 但是给药96 h后， 5%的HepG2/lis细胞就可杀死90%的细胞， 表现出较为明显的旁观者效应。这一结果提示该自杀基因系统具有明显的“好施者”效应。所谓“好施者”效应（“Good Samaritan” effect）是指转染自杀基因的细胞受到旁观者细胞（周围不含有自杀基因的细胞）保护， 生存周期得以延长的效应称为好施者效应[7]。该效应在延长了转基因细胞存活时间的同时， 也同时延长了其传递基因表达产物的时间， 进一步增强了旁观者效应的杀伤作用。在HSVTK/GCV、 CD/5FC等自杀基因系统中也存在“好施者”效应， 但由于杀伤性物质多产生于细胞内或不易扩散， 使得转染细胞较早即被杀伤， 不能够表达更多的产物对周围非转染细胞产生杀伤作用， 表现出微弱的“好施者”效应。Cortes等[1]认为在lis/lin系统中由于具有杀伤作用的CN-离子产生于细胞外， 可以迅速扩散到周围细胞， 使得含有自杀基因细胞内的CN-离子浓度同周围细胞相一致， 在一定时间内， CN-离子浓度达不到杀伤作用浓度， 保证了linamarase的持续表达， 扩大了对周围非转染细胞的杀伤范围， 从而表现了强大的旁观者效应。关于lis/lin系统“好施者”效应的发生机制有待通过对lis的定位表达、 细胞培养上清CN-浓度的变化曲线、 转染细胞及周围细胞的亚细胞结构观察等试验加以进一步研究验证。

参考文献

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