抗原特异性Th17细胞的分化与调节

　　　　 作者：杨静， 贾磊， 李丽， 吴长有

【摘要】 目的: 探讨影响抗原特异性Th17细胞分化和调节的因素。方法: T细胞受体转基因小鼠(DO11.10)CD4+T细胞， 与同背景正常小鼠的脾细胞混合， 经OVA多肽刺激后， 在不同的Th17极化的培养条件下， 观察Th17细胞及细胞因子的产生。 结果: 单纯OVA抗原刺激主要诱导特异性Th1型反应， 在TGFβ和IL6存在的条件下， 主要诱导Th17反应; 当加入IL23之后， 促进了Th17细胞的分化。阻断了IFNγ和IL4之后， Th17细胞的百分率明显增加。LPS可以促进Th1型细胞因子的产生， 但对抗原特异性Th17细胞的分化没有明显的促进作用。结论: 抗原特异性Th17细胞是与Th1、 Th3相对独立的细胞亚群， TGFβ、 IL6和 IL23可诱导或促进Th17的分化， 而Th1和Th3细胞因子抑制其分化。

【关键词】 Th17 T细胞亚群 流式细胞术 细胞因子

　　[Abstract] AIM: To assess the differentiation and regulation of antigen specific Th17 cells in vitro. METHODS: Nave CD4+ T cells from OVATCRtransgenic mice (OVATCRTg) were isolated and cocultured with splenocytes from normal BALB/c mice under different culture conditions. The expression and production of IL17 and other cytokines were assessed. RESULTS: OVA peptide alone mainly induced Th1 type responses. Addition of TGFβ plus IL6 induced Th17 response. Furthermore， addition of IL23 to cell culture could promote the differentiation of Th17 cells. Blocking of IFNγ and IL4 by neutralizing monoclonal antibodies enhanced the percentage of IL17producing cells. LPS could promote the production of Th1 cytokines but had no significant effect on IL17 expression. CONCLUSION: Antigen specific Th17 cells are distinct from antigen specific Th1 and Th3 cells. TGFβ， IL6 and IL23 are the factors responsible for promoting the differentiation and development of Th17 subset， whereas IFNγ and IL4 have inhibitory effects.

　　[Keywords]Th17 cells; T cell subset; flow cytometry; cytokine

　　按照CD4+T细胞分化和功能特征可以将其分为Th1和Th3细胞[1]。Th1型细胞通过分泌干扰素γ(IFNγ)等细胞因子介导细胞免疫; Th3型细胞通过分泌IL4等细胞因子介导体液免疫[2， 3]。Th1型免疫反应失调， 出现组织损坏和慢性炎症， 而Th3型免疫反应失调， 则导致过敏和哮喘疾病的发生[3]。近年来， 在类风湿关节炎、 实验性自身免疫性脑脊髓炎等自身免疫病和过敏原特异性反应研究中发现一种特殊的辅助型T细胞。这群CD4+T细胞同传统Th1和Th3细胞具有明显不同的特征: 主要分泌IL17， 表达控制其分化的独特的转录因子——孤独受体（orphan nuclear receptor， RORγt）[4]， 因此命名为Th17细胞。目前对于此细胞亚群的研究主要集中于其在疾病的发生发展中的作用， 而探讨影响抗原特异性Th17细胞的诱导和分化因素的报道较少。为此， 我们研究了体外培养体系中， 初始抗原特异性TCRTg CD4+T细胞， 经抗原刺激后， 探讨影响Th17细胞的诱导、 分化和调节的因素。为深入研究CD4+T细胞免疫调节效应和探讨自体免疫性疾病等免疫学机制提供实验和科学依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 OVA抗原特异性转基因BALB/c小鼠（DO11.10， TCRTg， 雌性， 6～8周龄）， 购自实验动物中心。PerCP标记的抗CD4（PerCPCD4)、 APC标记的抗IFNγ(APCIFNγ)、 PE标记的抗IL17(PEIL17)均购自美国BD/Pharmingen公司。FITC标记的抗KJ1.26单克隆抗体(mAb) 特异性识别转基因OVA抗原受体表达的细胞， 购自Caltag Laboratories（CA)。Recombinant Murine IL6、 human IL2和TGFβ购自PEPROTECH公司。LPS和布雷菲德菌素(brefeldin A， BFA)购自Sigma公司。antiIFNγ和antiIL4购自BioLegend公司。IL2、 IFNγ ELISA kit和 FACS Calibur流式细胞检测仪购自BD公司。Mouse IL23、 IL4和IL17 ELISA kit购自R&&D公司。RPMI1640培养液购自Gibco公司。小鼠淋巴细胞分离液购自达科为公司。ELX 800 Universal Microplate Reader酶联免疫检测仪购自BioTEK instrument.INC德国。

　　1.2 方法

　　1.2.1 TCRTg BALB/c小鼠单个细胞的制备 简言之， 取小鼠的脾脏， 研磨， 筛网过滤， 然后经小鼠淋巴细胞分离液密度梯度离心（800 r/min， 30 min）， 收取单个核淋巴细胞， 计数， 用RPMI1640培养液(含100 mL/L灭活胎牛血清、 50 g/L谷胺酰胺、 100 U/mL青霉素、 100 mg/L链霉素、 50 mol/L2ME)调整细胞密度为3×109/L。

　　1.2.2 细胞培养 新鲜分离的DO11.10小鼠单个核细胞与同背景BALB/c小鼠单个核细胞悬液按1∶4比例混合， 在有/无OVA多肽(OVA 323339， 1 mg/L)、 相应细胞因子(TGFβ 1 μg/L、 IL610 μg/L、 IL23 10 μg/L或抗细胞因子抗体αIFNγ5 mg/L、 αIL45 mg/L)不同组合的情况下培养4 d后， 新鲜RPMI1640培养液中加入低剂量IL2（10 U/mL）继续培养2 d， 收集细胞， 加入OVA多肽和αCD28 (终浓度1 mg/L)， 刺激的第1 h后， 加入BFA继续培养4 h， 用于细胞内细胞因子染色。

　　1.2.3 ELISA检测 培养4 d的细胞， 收集上清液， 低剂量IL2（10 U/mL）悬浮细胞2 d， 调节细胞密度到3×109/L。刺激孔加入OVA多肽和αCD28， 每个样品于96孔培养板上置3个复孔， 200 μL/孔， 37℃、 50 mL/L CO2培养48 h后， 收集培养上清液， 检测细胞因子浓度， 按照ELISA试剂盒说明书操作， 酶联检测仪检测结果。

　　1.2.4 细胞染色 首先进行细胞表面染色， 简言之， 细胞悬液， 加入荧光标记的抗细胞表面特异性抗原的抗体， 4℃避光反应30 min， 洗涤2次（800 r/min， 8 min）。之后进行细胞内细胞因子染色， 即将待测细胞用PBS洗涤2次后， 加入40 mL/L多聚甲醛， 室温固定8 min， 洗涤， 加入含有通透剂的缓冲液4℃过夜破膜， 加入特异性的胞内标记mAb， 4℃避光反应30 min， 洗涤2次， 染色缓冲液重悬细胞， 流式细胞术(FCM)进行检测。

　　1.2.5 FCM分析 应用FCM进行检测。首先设门于淋巴细胞， 再以CD4+KJ1.26+双标记细胞群开窗， CellQuest收集10000个细胞， FlowJo软件分析FCM结果。

　　1.2.6 统计学处理 所获数据用x±s表示， 显著性检验采用t检验分析。

　　2 结果

　　2.1 TGFβ和IL6诱导抗原特异性Th17细胞的分化 DO11.10小鼠和BALB/c小鼠单个核细胞悬液， 在OVA多肽和相应细胞因子存在的条件下培养， 刺激后检测细胞因子的表达。ELISA结果表明（图1A）， 单独抗原刺激以及加入TGFβ或者IL6后， 对IL17的产生都无明显作用， 但TGFβ和IL6二者协同则可以明显促进抗原特异性IL17的产生(P&<0.01)。流式结果表明（图1B）， 单独OVA刺激主要诱导Th1型细胞因子产生。单独加入TGFβ后， IL17+ T细胞百分率由2.65%降低到1.77%。单独加入IL6后， IL17+ T细胞百分率无明显变化， IFNγ+ T细胞百分率从6.26%降低到3.16%。在TGFβ和IL6协同诱导下， 即Th17极化培养条件下， IL17+ T细胞的百分率明显升高， 由2.65%升高到4.88%， 同时IFNγ+ T细胞百分率由6.26%降低到2.58%。

　　图1 TGFβ和IL6诱导抗原特异性Th17细胞的分化（略）

　　Fig 1 TGFβ plus IL6 induced the differentiation of Th17 cells

　　□Unstimulated; ■Stimulated. A: ELISA for IL17; B: Flow cytometry plots were gated on CD4+KJ1.26+ T cells. bP&<0.01 vs compared to OVA peptide alone.

　　2.2 IL23促进TGFβ和IL6诱导的抗原特异性Th17细胞的分化 进一步分析了IL23对Th17分化的影响， 培养条件中加入IL23和/或TGFβ， ELISA结果表明（图2A）， IL17的产生无明显变化， 但IL23却能明显地促进TGFβ和IL6诱导的抗原特异性IL17的产生（P&<0.01）。胞内染色结果与之相似（图2B）。与单纯抗原刺激相比， 加入IL23后， 抗原特异性的T细胞（即CD4+KJ1.26+细胞）中， IL17+T细胞的百分率由3.21%下降到2.25%; IL23与TGFβ协同作用， IL17+T细胞的百分率由3.21%下降到2.33%。在Th17极化培养条件中加入IL23， 刺激之后IL17+ T细胞的百分率由3.21%升高到10.12%， 同时IFNγ+ T细胞由6.53%降低到2.82%。

　　2.3 IFNγ和IL4抑制抗原特异性Th17细胞的分化 制备脾脏单个核细胞混合悬液， 在Th17极化条件下培养， 加入或不加入αIFNγ和/或αIL4。ELISA检测培养4 d的细胞上清， 结果表明（图3A）， 阻断了IFNγ之后， 上清中IFNγ的表达下降（P&<0.01）， 而IL17的表达水平明显增高（P&<0.05）。阻断了IL4之后， 上清中IL4的表达下降（P&<0.01）， IFNγ的表达增高（P&<0.05）， 而IL17的表达水平降低（P&<0.05）。当同时阻断了IFNγ和IL4后， IL17的表达最高， 差异具有统计学意义（P&<0.01）。2次培养刺激以后（图3B）， IL17表达水平的变化与一次培养相似。胞内染色结果表明（图3C）， Th17极化培养条件下加入αIFNγ后， IL17+T细胞百分率由7.44%上升到8.72%， IFNγ+ T细胞百分率由2.01%下降到1.39%。加入αIL4后， IL17+ T细胞百分率由7.44%下降到4.29%， 而IFNγ+ T细胞百分率由2.01%上升到13.22%。同时加入αIFNγ和αIL4后， IL17+T细胞百分率由7.44%上升到10.13%。

　　图2 IL23促进TGFβ和IL6 诱导的抗原特异性Th17细胞的分化（略）

　　Fig 2 IL23 enhanced Th17 differentiation induced by TGFβ plus IL6

　　□Unstimulated; ■Stimulated. A: ELISA for IL17; B: Flow cytometry plots were gated on CD4+KJ1.26+ T cells. bP&<0.01 vs compared to OVA peptide alone.

　　2.4 LPS对于抗原特异性Th17细胞的分化无明显促进作用 单个核混合细胞悬液在Th17极化条件下加或不加LPS培养后， ELISA检测2次刺激后细胞培养上清中的细胞因子含量。结果表明（图4A）， 中性培养环境中加入LPS后， 细胞培养上清中IFNγ的含量升高， 差异有统计学意义（P&<0.05）。而在Th17极化培养条件中加入LPS以后， 对IL17的产生无促进作用。FCM检测结果（图4B）与ELISA结果一致。OVA多肽培养同时加入LPS后， IL17+ T细胞百分率无明显变化， 分别为3.20%和3.45%， IFNγ+细胞百分率由6.73%明显升高到10.60%。Th17极化环境中加入LPS后， IL17+T细胞百分率由10.52%变为8.39%， IFNγ+细胞百分率无明显变化， 分别为3.29%和2.83%。

　　图3 IFNγ和IL4抑制抗原特异性Th17细胞的分化 （略）

　　Fig 3 IFNγ and IL4 inhibit the differentiation of antigen specific Th17 cells

　　□Unstimulated; ■Stimulated. A: ELISA for IL17， IFNγ and IL4 for 4 d culture supernatants; B: ELISA for IL17 for secondary culture supernatants; C: Flow cytometry plots were gated on CD4+KJ1.26+ T cells. aP&<0.05， bP&<0.01 vs primed without antibody.

　　图4 LPS对于抗原特异性Th17细胞分化的作用（略）

　　Fig 4 Effects of LPS on antigen specific Th17 differentiation

　　□Unstimulated; ■Stimulated. A: ELISA for IL17 and IFNγ; B: Flow cytometry plots were gated on CD4+KJ1.26+ T cells. aP&<0.05 vs primed without LPS.

　　3 讨论
　　
　　长期以来， 人们一般认为CD4+T细胞被活化、 增殖， 最终将分化为效应Th1和Th3细胞。随着对自身免疫病研究的深入， 人们发现很多现象不能用已知的Th1/Th3模式来解释。直至发现了一种新的细胞亚群——Th17细胞。有关Th17细胞在炎症和自身免疫性疾病发生发展中的重要作用， 最直接的证据是将EAE患病小鼠的Th17细胞被动转输正常小鼠后， 健康小鼠被诱导出严重的EAE[6]。
　　
　　目前对于Th17细胞诱导分化的研究基于多克隆刺激的基础上。Th17细胞的分化受许多细胞因子的调控。在小鼠的体外实验模型中， TGFβ和IL6联合作用可以诱导Th17的分化[7]; IL1β和TNFα能够促进TGFβ和IL6诱导的Th17细胞的分化[8]; IL12家族成员IL23能够促进Th17细胞的扩增和维持， 但是， 在体外， 单独的IL23不能诱导Th17的分化， 只能作用于记忆CD4+T细胞， 产生IL17[9]。Th1细胞和Th3细胞产生的细胞因子IFNγ和IL4抑制多克隆刺激下Th17细胞的分化。
　　
　　本实验中， 利用T细胞受体转基因小鼠(DO11.10)， 探讨细胞因子对Th17细胞分化的作用， 结果表明， TGFβ和IL6对抗原特异性Th17的分化起协同作用， 细胞培养上清中IL17的分泌水平约1200 ng/L， 而IL23能够促进由TGFβ和IL6诱导的Th17细胞的分化， 使IL17的分泌水平达到5000 ng/L。IL23单独作用或者与TGFβ协同作用对抗原特异性Th17细胞因子的产生无促进作用。这一结果与目前文献报道的多克隆刺激下的结果一致。有关人Th17细胞研究结果表明， 部分Th17细胞同时分泌IFNγ， 而动物实验中， Th1 和Th17是截然不同的细胞亚群[10]， 本次实验也证明了这一点。另外， 加入IFNγ和IL4的中和性抗体之后， 抗原特异性的Th17细胞的比例增高， 细胞培养上清中IL17的分泌水平达到6000 ng/L， 进一步说明了IFNγ和IL4对抗原特异性的Th17细胞有抑制作用。
　　
　　众所周知， 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）通过与免疫细胞的TLR4结合促进Th1细胞的分化[10]。有文献报道， LPS可以刺激DC分泌多种促炎因子， 在提供外源性TGFβ的情况下， antiCD3和antiCD28刺激后初始CD4+T细胞分化为Th17细胞[11]。本实验结果表明， 在中性环境下， LPS能够促进IFNγ的表达， 但是在Th17极化的培养环境下， LPS对IL17以及IFNγ的表达并无促进作用。其原因可能与以下几点有关: （1）本实验采用OVA多肽特异性刺激， 刺激条件与多克隆刺激不同; （2）LPS对IFNγ的产生有促进作用， 可能在一定程度上抑制了Th17细胞的分化; （3）Th17极化条件下， 提供的外源性细胞因子相对减弱了LPS的作用。但其详细的机制有待进一步研究。
　　
　　综上所述， 本研究结果证明了初始抗原特异性CD4+T细胞可以分化为Th17细胞， 这一过程受到多种细胞因子的调控。本实验探讨了Th17细胞分化最佳的诱导条件， 为进一步研究Th17细胞的生物学活性和功能， 以及其在临床疾病中的作用提供了理论依据。

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