血小板、 红细胞对T细胞亚群的调控作用

　　 作者：初明梅， 钱宝华*， 王海峰， 查占山， 花美仙， 郭峰

【摘要】 　　目的: 在体外实验中， 探讨血小板和红细胞对T细胞亚群的调控作用。 方法: 流式细胞术测定血小板CD59、 红细胞CD59、 T细胞CD3+CD4+、 CD3+CD8+的表达水平。按不同的实验条件进行分组， 全血细胞组、 有PL无红细胞(RBC)组、 无血小板(PL)组、 无RBC无PL组。同时观测各组抗原刺激前后T细胞变化。结果: 各组T细胞CD3+CD4+、 CD3+CD4+/CD3+比较: 全血细胞组&>有PL无RBC组， 抗原刺激前后（P&<0.001）; 有PL无RBC组&>无RBC无PL组刺激前(P&>0.05)刺激后（P&<0.05）。各组T细胞CD3+CD8+表达无明显变化。各组CD3+CD8+/CD3+比较: 全血细胞组&<有PL无RBC组抗原刺激前后（P&<0.01）; 有PL无RBC组&<无RBC无PL组刺激前（P&>0.05）刺激后（P&<0.05）。全血细胞组和无PL组比较各项指标均无统计学意义（P&>0.05）。抗原刺激前RBCCD59与CD3+CD4+在全血细胞组中负相关（P&<0.05）; 而在无PL组中则无相关性; PLCD59与CD3+CD8+CD3+全血细胞组中的正相关无统计学意义(P&>0.05); 而在无红细胞组中则呈负相关（P&<0.05）。结论: 活化血小板、 红细胞均可正向调节CD3+CD4+/CD3+， 负向调节CD3+CD8+/CD3+。

【关键词】 血小板 红细胞 CD4+T细胞 CD8+T细胞 CD59

　　机体免疫应答是一个非常复杂的过程， 需要淋巴细胞和许多免疫细胞共同协调作用来完成。以往研究表明， 由于免疫系统的调节机制复杂， 细胞、 细胞因子微环境等多种因素影响着免疫应答的程度。血液系统如何维持一种免疫平衡状态仍未被充分认识。由于特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenia purpura， ITP）、 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus， SLE）等自身免疫病的免疫失衡状态不同， 临床表现变化多样， 临床治疗也只能局限于治标不治本的方法。认清免疫系统的平衡调节过程具有重要的临床意义和应用价值。本实验初步探讨了正常人外周血中血小板（platelet， PL）和红细胞(red blood cell， RBC)调控T淋巴细胞亚群相互协调的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 健康成人(7名， 男性， 年龄35～45岁)ACD抗凝新鲜全血由中国人民解放军上海血站提供。红细胞裂解液（10倍）、 抗CD59单克隆抗体（mAb）、 抗CD3/CD4多克隆抗体、 抗CD3/CD8多克隆抗体均购于美国BD公司。S180（5×109/L）为长海医院输血科免疫实验室提供。

　　1.2 方法

　　1.2.1 红细胞和白细胞混合液(SRBC+WBC)制备 取10 mL ACD抗凝全血， 1500 r/min离心5 min， 血浆留取另一试管备用; 沉淀细胞用生理盐水（NS）洗2次（2500 r/min离心5 min）， 用NS恢复原体积， 混匀为SRBC+WBC。

　　1.2.2 白细胞悬液制备 取适量制备的SRBC+WBC， 每0.8 mL全血细胞加4 mL蒸馏水在冰水中（约-4℃）轻轻混匀作用约1 min（&<1 min）， 立即加18 g/L氯化钠溶液4 mL混匀， 2500 r/min离心5 min（若RBC未破坏完全， 再用2 mL蒸馏水在冰水中轻轻混匀作用&<30 s， 立即18 g/L氯化钠溶液2 mL混匀， 再以1500 r/min离心5 min）， 沉淀细胞恢复到原体积（达标准化）即WBC悬液， 使其浓度与SRBC+WBC的WBC浓度相同。

　　1.2.3 富血小板血浆（PRP）制备 吸取上层血浆， 混匀即为PRP。显微镜下观察富血小板。

　　1.2.4 纯血浆的制备 取适量PRP， 3500 r/min离心 15 min， 上清即为纯血浆; 显微镜下观察无PL、 无RBC。

　　1.2.5 免疫反应体系设计 分为4种不同的实验条件进行试验研究。全血细胞组: 0.3 mL PRP+0.2 mL NS+0.2 mL SRBC+WBC; 有PL无RBC组: 0.3 mL PRP+0.2 mL NS+0.2mL WBC; 无PL组: 0.3 mL纯血浆+0.2 mL NS+0.2 mL SRBC+WBC; 无RBC和PL组: 0.3 mL纯血浆+0.2 mL NS+0.2 mL WBC。同时以上各组S180刺激作为对照。以上试管加样后37℃孵育作用1 h， 每20 min混匀1次。孵育后以1500 r/min离心5 min， 分离上清和沉淀细胞用于流式测定。

　　1.2.6 各组监测指标分析 应用FCM测定各组PLCD59、 RBCCD59和T淋巴细胞CD3+CD4+、 CD3+CD8+的表达。采用直接免疫荧光法， 抗CD59 mAb， 抗CD3/CD4多克隆抗体、 抗CD3/CD8多克隆抗体分别为CD59PE标记、 CD3FITC标记、 CD4PE标记、 CD8PE标记， 结果用Cell Quest软件分析。

　　1.2.7 统计学处理 组间比较采用LSDt检验， 变量间关系研究采用相关分析， 应用SPSS11.5软件进行统计处理。

　　2 结果

　　2.1 各组T淋巴细胞表达CD3+CD4+、 CD3+CD8+的变化结果 各组T细胞CD3+CD4+比较: 有无S180刺激， 全血细胞和无PL组比较无统计学意义（P&>0.05）。全血细胞组&>有PL无RBC组S180刺激前后（P&<0.01); 有PL无RBC组&>无RBC无PL组刺激前(P&>0.05)、刺激后（P&<0.05）; 各组T细胞CD3+CD8+表达变化均无统计学意义（表1）。

　　表1 各组T淋巴细胞CD3+CD4+、 CD3+CD8+表达 （略）

　　aP&<0.05 vs有PL无RBC组; bP&<0.01 vs 全血细胞组.

　　2.2 各组CD3+CD4+/ CD3+、 CD3+CD8+/CD3+的变化结果 各组CD3+CD4+/CD3+比较: 有无S180刺激， 全血细胞组&>有PL无RBC 组（P&<0.001）; 有PL无RBC组&>无RBC无PL组刺激前(P&>0.05)刺激后(P&<0.05）。各组CD3+CD8+/ CD3+比较: 全血细胞组&<有PL无RBC组S180刺激前后（P&<0.01）; 有PL无RBC组&<无RBC无PL组刺激前(P&>0.05)刺激后（P&<0.05）。全血细胞组与无PL组比较各指标均无统计学意义（P&>0.05， 表2）。

　　表2 各组CD3+CD4+/CD3+、 CD3+CD8+/ CD3+的结果（略）

　　aP&<0.05 vs有PL无RBC组; bP&<0.01 vs全血细胞组.

　　2.3 无刺激各组PLCD59、 RBCCD59与CD3+CD4+、 CD3+CD8+、 CD3+CD4+/CD3+、 CD3+CD8/CD3+的相关性结果全血细胞组PLCD59&<有PL无RBC组PLCD59（111.56±22.68 vs 164.68±48.36， P&<0.05)。全血细胞组、 无PL（有RBC）组表达结果为RBCCD59（105.96±23.02 vs 103.67±41.66， P&>0.05）， 无统计学意义。S180刺激前各指标相关性结果（表3）， 刺激后各指标相关性均无统计学意义(未出示)。

　　表3 无刺激各组PLCD59、 RBCCD59与CD4+、 CD8+、 CD4+/CD3+、 CD8+/CD3+的相关性结果（略）

　　3 讨论
　　
　　T淋巴细胞是细胞免疫系统的主要成分， T淋巴细胞亚群之间的平衡与否， 直接影响着机体的免疫功能以及与感染性疾病的状态密切相关。T细胞亚群的平衡调节过程是个动态的过程，并受内环境中细胞传递的各种的不同信号所调控［1］。红细胞、血小板可调节T细胞活性[2， 3]。本实验结果与上述结论是一致的， 并证明血小板、 红细胞对CD3+CD8+的变化无影响。本实验结果还显示， S180刺激前红细胞可正调控CD3+CD4+/CD3+， 负调控CD3+CD8+/CD3+; 血小板不能引起各指标变化。我们比较S180刺激后各组CD3+CD4+/CD3+: 全血细胞组（53.78%±10.62%）&>无RBC组（36.25%±9.62%）， 无RBC组&>无RBC无PL组（32.34%±9.46%）， 全血细胞组（53.78%±10.62%）与无PL组（53.02%±8.94%）比较均无统计学意义; 说明红细胞可正向调节CD3+CD4+/ CD3+; 无红细胞存在时， 活化血小板可正向调节CD3+CD4+/CD3+; 红细胞正调控能力更强。比较S180刺激后各组CD3+CD8+/CD3+: 全血组（40.73%±5.05%）&<无RBC组（48.49%±6.92%）， 无RBC组&<无RBC无PL组（52.72%±5.26%）， 全血细胞组（40.73%±5.05%）与无PL组（40.55%±4.90%）比较无统计学意义。说明红细胞可负向调节CD3+CD8+/CD3+; 无红细胞存在时， 活化血小板可负向调控CD3+CD8+/CD3+。
　　
　　S180刺激前后， 全血细胞组与无PL组比较各指标均无统计学意义， 是否在全血免疫系统中血小板不发挥调控T细胞的作用？ 血小板和红细胞之间存在怎样的相互影响关系？ 由于血小板的激活反应除多与补体的活化程度有关外， 还与血小板膜表面的补体调节蛋白有关。在各种细胞膜表面的补体调节蛋白中CD59所起的作用最为重要[4] 。此外， CD59能介导细胞活化信息， CD59可与T细胞CD2相作用参与T细胞活化。我们通过比较RBCCD59、 PLCD59与T细胞表面免疫分子之间的变化来辅助判断各组中血小板、 红细胞的调控能力的变化。未受S180刺激时全血细胞组中RBCCD59与无PL组RBCCD59无统计学意义， 全血细胞组中RBCCD59与CD3+CD4+呈负相关， 而在无PL组中则无相关性， 说明全血细胞组（血小板存在时）， 红细胞调控CD3+CD4+细胞的能力发生变化。在维持机体免疫平衡过程中， RBCCD59并未发生调控作用。1981年Siegel等提出红细胞可通过识别C3b受体黏附到抗原抗体补体复合物上。 我们比较PLCD59的变化发现， 全血细胞组PLCD59&<无RBC组PLCD59， 说明全血细胞中PLCD59已经下降， MAC攻击血小板的能力增强， 正常全血中血小板可能处于一种亚激活状态。由上述分析结果已得知， 活化血小板具有调控CD4+T、 CD8+T细胞亚群的能力， 活化的血小板可正向调节CD3+CD4+， 所以全血中亚激活的血小板发挥调节T细胞能力。这与Kuwana等所报道相一致， 他们发现在正常体内环境， 血小板可以受到亚阈值的刺激而暴露GPIIbIIIa隐藏抗原肽， 并产生GPIIbIIIa反应性CD4+T细胞。全血细胞组中PLCD59与CD3+D8+/CD3+呈正相关性， 而在无红细胞组中两者则呈负相关， 说明在全血细胞组与无RBC组中， 血小板对于CD8+T细胞的亚群的调控作用发生改变。综合以上结果， 说明， 活化血小板、 红细胞均可正向调节CD3+CD4+/CD3+， 负向调节CD3+CD8+/CD3+。在机体未受S180刺激的免疫动态平衡过程中， RBCCD59并未参与作用， PLCD59则促进了血小板的调控作用。S180刺激时各指标相关性均无统计学意义， 比较S180刺激后各组CD3+CD4+/CD3+: 全血细胞组（无PL组）&>无RBC组&>无RBC无PL组; 各组CD3+CD8+/CD3+: 全血细胞组（无PL组）&<无RBC组&<无RBC无PL组。不难推测， 免疫性血小板缺失时（如无PL组）， 红细胞调控能力增强， 血小板存在时（如全血细胞组）， 红细胞的调控能力相对减弱。有报道红细胞一方面可使淋巴细胞CD25明显增高， 另一方面可吸附IL8、 TNFα等细胞因子使淋巴细胞CD25的表达水平下降。我们推测当血小板等因素调控淋巴细胞功能减弱时， 红细胞可发挥正向调控淋巴细胞的功能， 当血小板等因素调控淋巴细胞增强时， 红细胞通过吸附IL8、 TNFα等机制负调控淋巴细胞CD25的表达， 以维持淋巴细胞免疫活性的平衡状态。红细胞可能具有双重调控T细胞的能力。综上所述， 活化血小板、 红细胞均可正向调节CD3+CD4+/CD3+， 负向调节CD3+CD8+/CD3+。红细胞可能具有双重调控T细胞的能力。

参考文献

　　[1] Arosa FA， Pereiva CF， Fonseca AM. Red blood cells as modulators of T cell growth and survival[J]. Curr Phann Des， 2004， 10(2): 191-201.

　　[2] Meabed MH， Taha GM， Mohamed SO， et al. Autoimmune thrombocytopenia: flow cytometric determination of plateletassociated CD154/CD40L and CD40 on peripheral blood T and B lymphocytes[J]. Hematology， 2007， 12(4): 301-307.

　　[3] Elzey BD， Tian J， Jensen RJ， et al. Plateletmediated modulation of adaptive immunity. A communication link between innate and adaptive immune compartments[J]. Immunity， 2003， 19(1): 9-19.

　　[4] Farkas I， Baranyi L， Ishilkawa Y. CD59 blocks not only the insertion of C9 into MAC but inhihits iron channel formation by homologous C5b9[J]. J Physiol， 2002， 539(Pt2): 537-545.