小分子肽制备抗体方法的研究进展

　　　　　　 作者：郑树涛， 刘忠渊， 张富春

【关键词】 小分子肽 抗体制备 佐剂 偶联

　　许多生理调节所必须的因子都是很小的肽类， 生物技术的发展也促进了大量小分子基因工程肽类药物的出现， 因而小分子肽的分离、 纯化与鉴定技术日趋重要。小分子肽的界限划分迄今未有明确定义， 一般认为小分子肽的相对分子质量(Mr)均在3000以下[1]。在小分子肽的生物学功能、 鉴定与其相互作用的蛋白质的研究中， 特异性抗体是一重要的研究工具[2]。鉴于小分子肽仅有反应原性， 免疫原性较弱，因此在小分子肽制备抗血清过程中采取多种方法。

　　1 偶联载体和佐剂
　　
　　由于小分子肽仅有反应原性， 免疫原性较弱或无免疫原性， 通常需与大Mr载体蛋白偶联制备完全抗原(免疫原)， 借助载体蛋白的Ｔ细胞表位获得免疫原性， 以便刺激机体产生抗体[3]。制备完全抗原肽时常用的载体有牛血清白蛋白(BSA)、 钥孔血蓝蛋白(KLH)、 兔血清白蛋白(RSA)、 鸡卵清蛋白(OVA)、 人血清白蛋白(HSA)、 多聚赖氨酸(PLL)等。BSA是常用的多肽载体， 但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。因为与BSA偶联的多肽刺激产生的抗血清也含有针对BSA的抗体， 一次可能导致假阳性结果。KLH具有更高的抗原性， 是最为常用的多肽偶联载体。虽然KLH较大并有抗原性， 但在偶联过程中可能会沉淀， 因而有时候会很难处理。OVA是另一种可以使用的载体蛋白。当要检验抗体只是针对多肽而不是针对载体蛋白时， 用OVA作第二载体是很好选择。如果要将抗体抗载体蛋白的反应降到最低时，可以选用兔血清白蛋白做载体。
　　
　　此外， 为获得更好的免疫效果， 常使用免疫佐剂。免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用， 能增强机体针对抗原的免疫应答能力， 或改变免疫反应类型的物质。佐剂的作用原理是多样的， 不同的佐剂有不同的免疫增强方式。近年来， 许多新型的载体和佐剂被应用于抗体的制备。脂质体（liposome）就是其中之一。脂质体是人工合成的具有单层或多层单位膜样结构的脂质小囊， 由一个或多个类似细胞单位膜的类脂双分子包裹水相介质所组成， 具有佐剂兼载体效应。脂质体的结构有利于将抗原递呈给抗原处理细胞或其他免疫活性细胞。吞噬细胞吞噬脂质体并破坏其膜结构， 释放抗原并形成免疫复合物， 有利于维持长时间的高效价抗体及产生免疫记忆。脂质体在宿主体内可以生物降解， 本身无毒性， 并且能降低抗原的毒性， 无局部注射反应。脂质体与弗氏佐剂或氢氧化铝胶混合使用， 效果更佳。但是由于其稳定性， 生产和质量保证等问题使的脂质体仍无法用于人类。

　　2 将小分子肽进行融合表达
　　
　　在基因工程迅速发展的基础上， 有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起， 进而表达所需蛋白， 这种通过在人工条件下融合不同的基因编码区获得的蛋白质称为融合蛋白(FP)[4]。融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术， 可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌)也可在真核细胞中进行表达。原核表达系统的特点是时程短， 费用低， 是科研中的主要工具。其缺点是原核蛋白表达没有得到确切修饰， 大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物， 需要复杂的变性和复性过程， 大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多， 甚至可被改造成人源型， 真核细胞易被转染， 具有遗传稳定性和可重复性， 产物可被分泌， 提纯简单， 成本低。
　　
　　首先进行小分子肽基因的克隆:根据基因序列互补原则， 设计合适的引物序列， 以cDNA为模板， 利用PCR技术扩增出不同的目的的DNA片段。然后在载体中进行重组:通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收， 然后通过连接酶将两个具有相同的末端酶切位点的基因片段进行体外连接， 并克隆到高表达质粒载体中， 构建重组质粒。接着将重组表达载体转化/染宿主细胞并利用选择标记进行筛选及测序。最后是融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化[5]。原核表达载体pGEX4T1是小分子肽进行融合表达最常用的载体。其启动子上游有一个GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签， 其Mr为26000， 将编码小分子肽基因亚克隆到该载体上， 进行融合表达， 可以增加其相对分子质量。这样， 以融合蛋白的方式制备小分子肽的抗血清既有抗GST， 也有抗小分子肽的抗血清。其他常用的原核融合表达载体还有pET等。Wang等[6]基于蓖麻毒蛋白A链的晶体结构， 把CDR3环上表达抗蓖麻毒蛋白A链抗体（命名为rVHPT）的cDNA（全长360 bp）亚克隆到原核表达载体pET32a（+）上， 经过IPTG诱导表达， 用HisTrap（Co2+）成功地纯化出了抗蓖麻毒蛋白的抗体。Philippa等[7]将编码蛙皮素（magainin， 23个氨基酸左右）的cDNA的片段亚克隆到PET32a载体上与thioredoxin（ 硫氧还蛋白）一起进行融合表达， 然后将融合蛋白免疫兔子， 成功地制备了蛙皮素（magainin）的抗体。Natalia等[8]将编码骆驼IgG2亚型b和c的铰链区片段2bH和2cH分别亚克隆到原核表达载体pGEX5X2上与GST（谷胱甘肽巯基转移酶）进行融合表达， 成功地制备了2bH和2cH的抗血清。Yang等[9]将mRabL5的cDNA序列（全长558 bp）亚克隆到融合表达载体pGEX4T1上， 经过IPTG诱导表达， 将融合蛋白GSTmRabL注射兔子， 成功地制备了兔抗mRabL5抗血清。此外， 通过融合蛋白基因表达的方式获得包括若干功能域和报告域的融合蛋白， 通过这种方式可以制备同时具有免疫学特性功能域和酶催化特性报告域(如碱性磷酸酶、 荧光素酶、 绿色荧光蛋白等)的融合蛋白， 并利用其功能域对小分子肽的亲和性和报告域的酶促级联放大作用进行免疫学检测， 较之传统使用酶联第二抗体的方法节约了检测时间和检测成本。

　　3 质粒载体免疫
　　
　　将编码小分子肽的基因构建到真核表达载体上， 以质粒载体作为抗原， 直接导入动物细胞内， 从而通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白， 诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答[10]。质粒免疫又叫核酸免疫， cDNA免疫， 质粒裸DNA免疫等。质粒载体免疫所用的真核表达质粒有多种选择， 研究者大多数选择pcDNA3.1系列， pcDNA3.1（+/-）质粒载体以pUC质粒为基本骨架， 是一种常用的非融合蛋白类型高效真核表达载体。这种载体具有保证重组蛋白有效， 高水平表达的人巨细胞病毒（CMV）早期启动子/增强子; T7噬菌体RNA聚合酶结合的启动子， 使mRNA多腺嘌呤化和转录有效终止的牛生长激素多腺甘酸序列（BGHpA）等。Diestre等[11]将编码FasL基因cDNA序列分别亚克隆到真核表达载体pcDNA3， pRK5和pCMV1上， 然后将重组质粒注射兔子， 成功地获得了抗FasL的特异性抗体。Yang等[12]将Choristoneura fumiferana的蜕皮激素受体的cDNA（CfEcRB）的全长序列亚克隆到真核表达载体pVAC1mcs上， 然后将重组质粒免疫小鼠， 成功地制备了蜕皮激素受体的抗体。Cardones等[13]将编码LYVE1基因亚克隆到真核载体pMSCV上，　　用基因枪转染小鼠， 成功地获得了特异性很高的抗LYVE1蛋白的抗血清。质粒免疫在免疫应答中能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫， 在应用于小鼠、 绵羊、 鸡、 猫、 牛、 猪、 马、 猴和黑猩猩等动物身上均获得成功。但它在诱导免疫应答中的效率相对较低， 尤其是在大型动物中， 影响了它的实际应用[14]， 因此需要在实验中进行佐剂加强。细胞因子是一种常用的质粒免疫佐剂。它是由活性细胞分泌的具有生物活性的多肽或蛋白质产物， 其生物活性尤其侧重于对细胞生长的调节作用。细胞因子具有明显的免疫佐剂效应， 可增强病毒、 细菌和寄生虫疫苗的保护效应， 激发对肿瘤抗原的免疫反应， 细胞因子在体内缓慢而持久地释放， 不会对机体产生毒性作用。具有佐剂效应的细胞因子有干扰素（IFNα、 IFNβ和IFNγ）， 淋巴因子（IL2、 IL3、 IL5等）， 单核因子（IL1、 IL6、 IL8等）及其他细胞因子（TNF、 GMCSF）等。Zhang 等[15]将编码细胞因子GMCSF的基因和抗原基因TB（肺结核）亚克隆在真核表达载体pcDNA3.1上， 让其共同表达， 然后用质粒免疫小鼠， 结果能够增强T细胞应答。

　　4 质粒免疫后蛋白/菌液加强
　　
　　有时候， 真核质粒载体免疫动物后仅能够引起体液免疫而几乎不能够引发细胞免疫， 不能产生预期的效果， 这时需要用相应的蛋白来加强免疫。Dego等[16]将编码3磷酸甘油醛脱氢酶的基因gapb、 gapc和gapb/c分别亚克隆到真核质粒载体pBISIA上， 构件了pBISIAgapb、 pBISIAgapc和pBISIAgapb/c3种粒载来免疫小鼠， 并在4和8个星期后用相应的重组蛋白进行免疫加强。结果显示所获得的抗体滴度均要比未用重组蛋白进行免疫加强对照组抗体滴度高。Fukumoto 等[17]将编码p50蛋白的基因经过PCR扩增后亚克隆到pAK8上， 构建了pAK8p50真核表达载体。然后用来免疫狗， 每隔2个星期， 共免疫3次。最后1次质粒免疫的2个星期后， 用表达p50的菌液来加强免疫。结果显示产生了较高的滴度， 使狗对巴贝西寄生虫产生了较强的免疫性。但是， Kang等[18]将针对相同靶抗原的蛋白疫苗和DNA 疫苗共注射小鼠时， 发现产生了免疫抑制现象。相反， 如果来自不同病毒的， 或者抗原性不匹配的蛋白疫苗和DNA疫苗共注射小鼠时则不会产生免疫抑制效应， 并确认了CD4+CD25-T细胞作为调节T细胞类型是由抑制T细胞引起的并且是抑制T细胞活性的主要因素。

　　5 在小分子肽中引入MAP结构
　　
　　MAP（multiple antigenic peptide）体系代表着生成抗多肽抗体的另一种独特方式。该体系基于一个小的无抗原性的多分枝赖氨酸核， 在该赖氨酸核上同时并行合成了多个多肽。其结果是形成了一个三维大分子， 因为它有很高的多肽抗原比例， 因而不再需要使用载体蛋白来诱导抗体反应。每一个核分子可链接4个相同多肽。理论上讲， 与偶联到载体蛋白的单分子多肽相比， MAP具有一定的优势， 因为MAP的赖氨酸核与多肽抗原相比显得很小。这样抗原的浓度就会达到最高。因而MAP体系具有很高的抗原性， 与偶联到载体蛋白的单分子多肽相比， 具有很高的有效抗原浓度。复合体的高Mr使质量控制措施（质谱或分析性HPLC）很难实行。MAP的间接合成则解决了分析问题。间接合成时， 多肽首先合成、 纯化， 并作质谱或HPLC分析。合成的多肽抗原再通过Cys链接到赖氨酸核上。但由于抗原肽的Mr仅有8000左右， 在体内易于降解， 故免疫原性较低。传统的方法是将其与大分子的蛋白载体如KLH、 BSA交联后提高免疫原性， 但需要亲和层析纯化。他们在抗原肽中引入了MAP结构， 由于其免疫原性较弱， 不会影响抗原肽诱导的特异性免疫应答， 但却可以增加抗原肽的Mr， 提高其免疫原性。

　　6 结语
　　
　　以上主要介绍了目前在小分子肽抗体制备中使用的几种方法， 这几种方法都有其自身显著的优点， 然而在应用时也都不同程度地存在不足之处。例如: 小分子肽的纯化及合成的成本高， 且其纯化常常依赖于HPLC（高效液相色谱）因而纯化小分子肽难以普及。新型载体佐剂的使用可以为一些不利于诱导产生抗体的小分子肽提供一条便捷的制备抗体的途径， 但它目前也存在着新型载体佐剂不易获得或商品化程度低的缺点。偶联BSA， KLH等大分子载体蛋白， 偶联效率低且不稳定。融合蛋白涉及到包含体（由于对母体的杀伤）的变性和复性， 过程费时繁琐， 分离纯化时往往失败， 并且制备的抗血清为多抗。质粒免疫存在效价低， 需要多次免疫且常常需要相应的基因工程蛋白加强免疫。MAP体系在合成时可能会有问题。赖氨酸核的多分枝性允许多拷贝多肽的合成， 但如果合成的多肽较长， 位阻(现象)会成为问题， 导致该多聚体的有些肽链臂丢失氨基， 成为缺失性产品。但是， 这些方法在为研究者在抗体制备， 尤其是对小分子肽的抗体制备提供了更多的方法和思路。

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