人F1F0ATP合成酶β亚基的原核表达、 纯化及抗体制备

　　 作者：俞丽丽， 张元军， 张霞， 王怡波， 林建波， 倪健， 彭艳

【摘要】 　　目的: 原核表达、纯化人F1F0ATP合成酶β亚基（hATP5B）并制备其多克隆抗体。方法: 以人脐带静脉内皮细胞 （HUVEC） 总RNA为模板， 通过RTPCR扩增hATP5B 成熟肽编码序列， 克隆入原核表达载体pET28a(＋)， 转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)并诱导表达， 表达产物用Ni2+螯合层析纯化， 纯化产物用透析复性， 产物用SDSPAGE和 Western blot进行鉴定。复性产物免疫家兔， 制备多克隆抗体; 多抗的效价用间接ELISA法检测， 并用Western blot和细胞免疫荧光分析多抗的特异性和抗原结合性。结果: 测序证实获得hATP5B成熟肽编码序列。SDSPAGE鉴定表明， 表达、 纯化、 复性产物的相对分子质量（Mr）均约55000， 与理论值相符。灰度扫描分析重组hATP5B（recombinant hATP5B， rhATP5B）的表达量占菌体蛋白总量的36.8%， 纯化产物纯度达98.3%， 复性产物纯度达99.2%。Western blot反应阳性。多抗的平均抗体效价为1∶640000， 可特异识别HUVEC中的天然抗原。结论: 原核表达的hATP5B具有良好的免疫原性， 其免疫家兔后获得的多抗具有高效价和特异性。hATP5B的原核高效表达和其抗体制备为进一步研究hATP5B的功能奠定了实验基础。

【关键词】 hATP5B rhATP5B 原核表达 多克隆抗体

　　[Abstract] AIM: To express and purify the β subunit of human F1F0ATP synthase (hATP5B) in prokaryotic system， and generate its polyclonal antibody in rabbits. METHODS: The coding sequence of hATP5B mature peptide was amplified by RTPCR from human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and then cloned into prokaryotic expression vector pET28a(+). The plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3) to express hATP5B in reponse to IPTG induction. Expressed protein was purified by Ni2+ metalchelating chromatograph， and refolded by dialysis. The products were analyzed by SDSPAGE and Western blot. Refolded protein was injected into rabbits to generate polyclonal antibody. The titer of the polyclonal antibody was determined by indirect ELISA. The specificity and the binding ability were detected by Western blot and cell immunofluorescence analysis. RESULTS: DNA sequencing confirmed that the coding sequence of hATP5B mature peptide was completely concordant with the original sequence (NM_001686， hATP5B’s GenBank accession number). SDSPAGE showed that the relative molecular masses (Mr) of the expressed， purified， and refolded products were about Mr 55 000， which was in accordance with the predicted. Grayscale scanning showed that the expressed recombinant hATP5B (rhATP5B) accounted for 36.8% of the total bacteria protein， and the purity of purified product was 98.3%， of refolded 99.1%. The result of Western blot is positive. The titer of the polyclonal antibody was 1∶640 000， and it specifically recognized the native antigen in HUVEC. CONCLUSION: hATP5B expressed in prokaryotic system has strong immunogenicity， and the polyclonal antibody with high titer and specificity was obtained from immunization of rabbits. The high level prokaryotic expression of hATP5B and the preparation of its antibody lay the foundation for further function research of hATP5B.

　　[Keywords]hATP5B; rhATP5B; prokaryotic expression; polyclonal antibody

　　人F1F0ATP合成酶普遍存在于细胞线粒体内膜， 由F1和F0亚单位构成， 是一个将ATP合成与水解（由F1亚单位介导）同质子转运装置的旋转（由F0亚单位介导）耦联的机械化学酶[1]。F1亚单位的β亚基(hATP5B)是该酶的催化亚基， 具有ATP的合成与水解活性。近年发现， 该酶不仅存在于线粒体内膜， 在内皮细胞（EC）和肿瘤细胞质膜表面也有表达[2， 3]。F1亚单位的α/β亚基是抗肿瘤血管新生药angiostatin在EC表面的结合位点[4， 5]。Chi等制备的1株识别hATP5B催化活性位点的单克隆抗体(mAb)3D5AB1， 其EC血管分化抑制活性比angiostatin更强[6]， 故hATP5B可作抑制肿瘤血管新生的靶标。本研究用RTPCR方法获得了hATP5B成熟肽的编码序列， 将其克隆入携带Histag的原核表达载体pET28a(+)中， 并在E.coli BL21(DE3)中表达。在此基础上， 对其表达产物进行纯化及复性， 并用其免疫家兔制备了高效价和特异性的多克隆抗体。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 TRIzol试剂和SuperscriptIII反转录试剂盒均购自Invitrogen公司。原核表达载体pET28a(+)和E.coli BL21(DE3)购自Novagen公司。限制性内切酶、 T4连接酶购自NEB公司。核酸凝胶回收试剂盒及质粒小量快速抽提试剂盒购自上海华舜。填料Chelating Sepharose Fast Flow购自GE公司。透析袋SnakeSkinT Dialysis Tubing（10K MWCO）购自Pierce公司。鼠抗人ATP5B mAb购自BD Biosciences公司。HRP羊抗鼠IgG， HRP羊抗兔IgG均购自北京鼎国公司。荧光素羊抗兔IgG购自Invitrogen公司。成年雌性家兔（体质量为2.0 kg/只）购自上海中医药大学实验动物中心。

　　1.2 方法

　　1.2.1 hATP5B编码序列的扩增及重组表达载体构建 人脐静脉血管内皮细胞 （HUVEC）由本实验室自行分离。HUVEC细胞的总RNA抽提按TRIzol试剂说明书进行， 按SuperscriptIII反转录试剂盒说明书用RTPCR法扩增ATP5B的成熟肽的编码序列， PCR所用引物为: 5′端primer: 5′CGAGCTCGCGCAAACATCTCCTTCGC3′， 3′端primer: 5′CCAAGCTTTCACGATGAATGCTCTTC3′， 划线部分依次分别为Sac I和Hind III酶切位点。目的片段双酶切后， 连接至载体pET28a(+)， 转化E.coli Top10， 阳性克隆用菌落PCR及酶切鉴定。

　　1.2.2 重组hATP5B(recombinant hATP5B， rhATP5B)的表达、 纯化与复性 重组载体pET28a(+)ATP5B 转化E.coli BL21(DE3)。阳性单克隆培养过夜， 次日转接并培养至A600达0.8时， 加IPTG(终浓度1 mmol/L)诱导表达4 h， 取样SDSPAGE。离心收菌， 用裂解液(PBS，10 g/L Triton X100， 1 mmol/L PMSF)重悬并超声裂菌， 离心沉淀为粗制包涵体。用2 mol/L尿素洗涤2 h后离心， 8 mol/L尿素溶解过夜， 收上清。按GE公司说明书， 用镍柱亲和层析法纯化rhATP5， 取样SDSPAGE。调整洗脱液浓度至300 mg/L， 装入透析袋， 对20倍体积的复性缓冲液（PBS， 100 mL/L glycerol， pH7.5）透析， 4℃过夜， 用镍柱浓缩后取样SDSPAGE。灰度扫描上述SDSPAGE凝胶， 分析rhATP5B占菌体总蛋白的百分率及纯化、 复性后的纯度。复性产物用Bradford法[7]测定蛋白终浓度。

　　1.2.3 Western blot检测表达产物 将E.coli BL21(DE3)空菌裂解液， 诱导的转化菌裂解液及纯化的融合蛋白SDSPAGE， 湿法转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜， 封闭过夜。鼠抗人ATP5B mAb作一抗（1∶1000）， HRP羊抗鼠IgG作二抗（1∶5000）， 二氨基联苯二胺（DAB）显色后观察结果。

　　1.2.4 兔抗rhATP5B多抗的制备及鉴定 将复性rhATP5B与等体积弗氏完全佐剂混合乳化， 免疫家兔， 1 mg/只， 背部皮下5点注射， 间隔2周， 共4次。7 d后颈动脉放血， 分离血清。复性rhATP5B以1 mg/L包板， 间接ELISA测定抗体效价: 抗血清稀释度为1∶1000～1∶1000000， 菌体蛋白包板作抗原的阴性对照， 免疫前兔血清作抗血清的阴性对照。抗血清用Protein A纯化得多抗， 用Western blot和免疫荧光染色鉴定。（1）Western blot: HUVEC裂解后进行SDSPAGE， 纯化rhATP5B作抗原的阳性对照， 菌体蛋白作抗原的阴性对照。制备兔多抗作一抗（1∶1000）， HRP羊抗兔IgG作二抗（1∶5000）， 免疫前兔血清作兔多抗的阴性对照， 方法同上。（2）免疫荧光染色: HUVEC用20 g/L多聚甲醛固定， 5 g/L Triton X100处理， 10 g/L BSA封闭。以制备兔多抗为一抗， 荧光素羊抗兔IgG为二抗， DAPI染核， 封片， 荧光显微镜观察、 拍照。

　　2 结果

　　2.1 ATP5B编码序列的扩增和表达载体pET28a(+)ATP5B的构建 HUVEC细胞抽提RNA后电泳鉴定其抽提完整性， 28 S、 18 S和5 S rRNA清晰可见， 证明抽提的RNA完整性良好。以抽得RNA进行RTPCR， 扩增ATP5B序列， 以扩增βactin作为阳性对照。扩得ATP5B片段长1600 bp， 同预期大小相符; 将该片段的测序结果与hATP5B的GenBank序列比较， 所得序列正确无误。将其克隆入携带Histag的载体pET28a(+)， 对克隆进行菌落PCR和酶切鉴定（图1）。测序结果显示， 序列正确且插入载体后读码框未改变。

　　图1 hATP5B的克隆　　Fig 1 Cloning of hATP5B（略）

　　1: RTPCR of βactin; 2: RTPCR of hATP5B; 3， 6: Negative clones identified by PCR; 4， 5， 7: Positive clones identified by PCR; 8: Plasmid control before digestion; 9: Plasmid digested with Sac I; 10: Plasmid digested with Hind III; 11: Plasmid digested with Sac I and Hind III; M: DNA marker.

　　2.2 rhATP5B的原核表达， 纯化及复性 用pET28a(+)ATP5B转化感受态E.coli BL21(DE3)， 诱导后在Mr约55000处出现1浓染带， 同预期大小相符（图2， 泳道3）。灰度扫描显示， rhATP5B的表达量占菌体蛋白总量的36.8%， 实现了高效表达。菌体裂解后上清与沉淀分别电泳， 发现目的蛋白主要分布在裂解沉淀中， 说明表达的rhATP5B蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体蛋白经纯化， 纯度达98.3%。纯化蛋白经复性， 纯度达99.2%; Bradford法测其浓度为1.2 g/L。rhATP5B经粗提、 纯化、 复性后的得率为19.5%（表1）， 说明此方法能够用于纯化、 复性目的蛋白。

　　图2 重组人ATP5B的表达， 纯化及复性（略）

　　Fig 2 SDSPAGE analysis of expression， purification and refolding of Histagged rhATP5B

　　1: PageRulerTM prestained protein ladder; 2: Noninduced; 3: Induced; 4: Supernatant of cell lysates; 5: Inclusion bodies; 6: Denatured inclusion bodies; 7: Purified rhATP5B; 8: Refolded rhATP5B.

　　表1 rhATP5B的纯化和复性（略）

　　Tab 1 Purification and refolding of rhATP5B

　　2.3 rhATP5B蛋白的Western blot鉴定 用鼠抗人ATP5B的mAb进行Western blot分析， 鉴定rhATP5B蛋白。结果显示， 诱导4 h的pET28a(+)ATP5B转化菌、 超声裂解沉淀、 纯化后的蛋白样品， 在Mr约55000处均有一条带（图3， 泳道4-6）， 而在空菌E.coli BL21(λDE3)和诱导前的pET28a(+)ATP5B转化菌中没有条带出现， 这说明已成功表达和纯化了rhATP5B蛋白， 纯化蛋白仍保持其免疫结合活性。

　　2.4 兔抗rhATP5B多抗的鉴定 以复性rhATP5B免疫家兔， 间接ELISA检测抗血清效价， 免疫后兔血清的平均效价为1∶640000， 而免疫后兔血清与菌体蛋白不反应， 免疫前兔血清与rhATP5B不反应， 表明获得了高效价的抗rhATP5B血清， 抗血清经Protein A纯化得多抗。Western blot显示， 制备多抗在Mr约55000处与HUVEC中hATP5B有特异性反应(图4)， 同与纯化rhATP5B的反应条带位置一致。该多抗与HUVEC中其他蛋白无交叉反应， 与菌体蛋白无交叉反应， 免疫前兔血清与HUVEC全蛋白、 纯化rhATP5B均不反应， 表明多抗具有高特异性。制备多抗的HUVEC免疫荧光分析表明， 多抗能识别HUVEC中的hATP5B（图5B）， 因此具有天然抗原的结合活性。

　　图3 Western blot鉴定表达的rhATP5B蛋白（略）

　　Fig 3 Western blot analysis of expressed rhATP5B

　　1: PageRulerTM prestained protein ladder; 2: BL21(DE3); 3: Noninduced; 4: Induced; 5: Inclusion bodies; 6: Purified rhATP5B.

　　图4 HUVEC全细胞裂解液进行Western blot分析（略）

　　Fig 4 Western blot analysis of whole cell lysates of HUVEC

　　1: PageRulerTM prestained protein ladder; 2: Total protein in HUVEC stained with antirhATP5B polyclonal antibody; 3: Purified rhATP5B stained with antirhATP5B polyclonal antibody; 4: Cell lysates of BL21(DE3) stained with antirhATP5B polyclonal antibody; 5: Total protein in HUVEC stained with preimmune rabbit serum; 6: Purified rhATP5B stained with preimmune rabbit serum.

　　图5 HUVEC进行免疫荧光分析（略）

　　Fig 5 Immunofluorescence ananlysis of HUVEC

　　A: HUVEC stained with DAPI; B: HUVEC stained with antirhATP5B polyclonal antiboy and DAPI.

　　3 讨论
　　
　　hATP5B全长蛋白， 不仅包括其成熟肽部分， 还包括其N端的线粒体导肽， 该导肽在人细胞中将hATP5B蛋白的无活性前体引导至靶膜， 随后该导肽被导肽酶切割， 仅留下成熟肽。但在原核系统中不具备对该导肽的识别和切割机制， 表达该导肽却不能被切割， 会影响成熟肽的表达和复性。故本研究在原核表达hATP5B时， 未表达其全长， 而只表达了其成熟肽区， 更精确地模拟了活性hATP5B的结构。
　　
　　重组hATP5B的表达量较高， 主要以包涵体形式存在， 其N端的组氨酸标签被包埋在包涵体内部， 不利于与Ni2+螯合， 故在纯化前用含8 mol/L尿素的包涵体溶解液溶解蛋白， 充分暴露其组氨酸标签， 以利于Ni2+螯合层析。在包涵体溶解液中加入20 mmol/L的咪唑， 能有效防止杂蛋白对Ni2+柱的吸附。洗脱缓冲液中应采用的咪唑浓度进行预实验， 发现50 mmol/L的咪唑不能洗脱目的蛋白， 100 mmol/L能洗脱目的蛋白， 纯度为98.3%， 而150 mmol/L与100 mmol/L洗脱等量的目的蛋白， 但比100 mmol/L洗脱更多杂蛋白， 纯度仅为90%， 故选用100 mmol/L咪唑的洗脱缓冲液。
　　
　　本研究中得到的纯化产物为变性蛋白， 以变性蛋白作抗原， 仅能提供线性表位， 不能提供空间构象表位， 要筛选到针对空间构象表位的mAb， 需对纯化产物进行复性。我们曾尝试稀释和透析两种复性方法。在稀释复性时使用的是QuickFold蛋白复性试剂盒， 得率为7.6%， 而透析复性的得率为19.5%， 故透析法更适用于该蛋白的复性。用复性蛋白作抗原， 免疫家兔得高效价、 特异性多抗， 说明复性蛋白具有良好的免疫原性。Western blot分析表明制备多抗与HUVEC中hATP5B特异结合， 细胞免疫荧光分析表明多抗识别HUVEC中hATP5B天然抗原。本实验室还用该多抗对石蜡包埋的肝癌、 肺癌病理组织切片进行了免疫组化检测， 结果为阳性， 多抗与存在于胞膜和胞质的hATP5B天然抗原均有结合。与国外的ProSci、 Atlas公司研制的抗ATP5B多抗相比， 该多抗的交叉反应小， 反应强度大， 且能广泛应用于ELISA， Western blot， 细胞免疫荧光， 免疫组化等多种实验。hATP5B的原核高效表达和其抗体制备为进一步研究hATP5B的功能奠定了实验基础。

参考文献

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