Exosome一种新型的潜在的抗肿瘤疫苗

【关键词】 树突状细胞 肿瘤细胞 胞外体 免疫治疗

　　胞外体是真核细胞释放的， 含有多种细胞膜分子以及相关蛋白的小囊泡。系由细胞内的多泡体(multivesicular bodies， MVBs)膜与细胞膜融合后释放到细胞外环境中囊泡状结构， 被称之为胞外体（exosome， EXO）。多种类型细胞均能以这种胞外分泌的方式释放EXO。抗原提呈细胞（APC）， 如树突状细胞 (dendritic cells， DC)、 B细胞， T细胞、肥大细胞、肠上皮细胞以及肿瘤细胞等均可释放EXO［1， 2］。APC分泌的EXO富含MHCI、 II及共刺激分子， 在动物模型中能够发挥有效的免疫刺激作用和抗肿瘤免疫［3］。1998年首次应用负载肿瘤抗原的DC释放的EXO（dendritic cellderived exosome， Dexo）免疫小鼠成功使荷瘤小鼠的肿瘤消退［4］。这一研究结果激起了对应用胞外体进行肿瘤的免疫治疗兴趣。目前已完成了两个应用Dexo治疗恶性黑色素瘤和非小细胞肺癌的临床实验［3］。现就DC胞外体Dexo和肿瘤细胞胞外体 (tumor cellderived exosomes， Texo)的生物学特性作一综述， 重点介绍其免疫活性以及基于EXO的肿瘤免疫治疗的研究进展。

　　1 胞外体的生物发生学及其成份
　　
　　Trams等在1981年首先在正常细胞和肿瘤细胞的培养上清液中发现并描述了一种囊泡结构， 6年后Johnstone等从网织红细胞的培养上清液中分离纯化了这种囊泡， 并将其命名为“胞外体(exosome) ”。胞外体在电镜下呈典型的杯状，由双层脂质膜包绕的扁平半球体， 直径约50～100 nm， 这些特征与MVBs内部小囊泡相一致［3］。胞外体携带来源细胞的一些特定的膜蛋白、 胞质溶胶蛋白及脂质进入细胞外环境中。这些EXO可作为细胞功能的使者， 参与多种生理及病理生理过程。多种造血和非造血细胞以及多种肿瘤细胞等均能释放EXO［3］。
　　
　　EXO的组成成分随细胞来源不同而有所差异。Dexo包含有多种胞质蛋白(如Annexin II， 热休克同源蛋白Hsc73)， 几种膜蛋白(如MHCII类分子， 共刺激分子及CD9等)。近年来对EXO的蛋白组学分析结果显示， EXO含有胞质蛋白主要有以下两类: (1)细胞内普遍存在的蛋白: 微管蛋白、 肌动蛋白及其结合蛋白、 Annexin、 以及Rab 蛋白以及一些信号转导分子如蛋白激酶， 1433以及G蛋白异三聚体等［5］。其中最丰富的蛋白成分之一是四次跨膜蛋白（tetraspanins， TS）蛋白家族， 包括CD9、 CD63、CD37、 CD53、 CD81和CD82［3， 5］。在细胞膜， TS 形成一个参与一系列具有重要生理作用的蛋白有关的脂蛋白区， 这些蛋白包括整合素、 抗原提呈分子以及受体等， 在EXO与细胞的黏附、融合以及免疫刺激方面发挥重要的作用。同时他们在蛋白肽与MHCI 类 和 II类分子形成大的蛋白复合物方面也发挥重要的作用［6］。 (2)与细胞特殊功EXO能有关的蛋白: 如Dexo含有MHCI 类和II类分子、 共刺激分子以及热休克蛋白等。这些蛋白可能直接参与胞外体与细胞之间的分子传输， 同时也参与了抗原肽与MHCI类分子的结合和装配。Hsc70 是Dexo的一个主要的蛋白成分， 与其在APC表面受体的作用引发了一系列诱导初始免疫的反应［7］。最近的研究显示， Dexo除了表达上述膜分子外， 还表达CD54、 CD11c、 CCR7、 Tolllike receptor (TLR)4， TLR9 以及 MyD88等［3， 8］。其他负载在胞外体上的分子还有MFGE8（milk fat globule EGF factor 8）/lactadherin， 在小鼠DC以及一些肿瘤细胞的EXO中比较丰富［3］。由于该分子含有介导结合ανβ3 和ανβ5 整合素的 RGD 基元， 因此认为该分子在介导EXO结合到表达整合素的APCs上起重要作用［3］。最近的研究还显示lactadherin 参与了血管内皮细胞生长因子依赖性的血管再生［9］， 提示， 负载lactadherin的EXO对那些需要血管再生的治疗也许是有益的。另外在一些肿瘤细胞的Texo中也发现有 lactadherin表达。提示其可能与一些因子协同地刺激肿瘤微环境中的新生血管形成而促进肿瘤的生长。Annexins是钙依赖的磷脂结合蛋白， 在细胞膜转运、离子通道活性的调节、以及炎症反应中发挥作用［10］。

　　2 胞外体的分离和纯化
　　
　　EXO的密度为1.13～1.19 g/mL。这种生物学特性使得从细胞培养液， 血液以及肿瘤性渗出液等体液中分离纯化EXO成为可能［3］。常用的提取和纯化胞外体的方法是通过一系列的离心从培养细胞的上清液中去除细胞和大的细胞碎片，然后利用超速离心沉淀EXO［4， 11］。但这种方法难以将EXO与其他小囊泡结构或大的蛋白聚集物区分开来。可利用EXO特有的密度， 通过蔗糖密度梯度悬浮的方法， 很容易将其中混杂的物质如蛋白聚集物或细胞凋亡的核小体碎片等分离出来［3， 5］。目前已经建立了面向临床应用的GMP级EXO的制备和纯化程序［3］。首先， 培养物上清经孔径3 μm/8 μm的滤膜过滤， 继之用500 kD中空纤维膜超滤澄清的培养物上清， 然后， 进行100 000 g超速离心沉淀到30%蔗糖/氧化氘垫层(密度1.13～1.210 g/mL)上， 最后， 重悬胞外体沉淀， 经全滤过消毒后即得到GMP级胞外体。
　　3 DC胞外体在肿瘤免疫治疗中的应用
　　
　　肿瘤细胞可通过以下途径获得免疫逃逸: (1)表达异常的或低表达肿瘤特异性抗原(TSA)和肿瘤相关抗原(TAA); (2)下调MHCI和II类分子的表达; (3)肿瘤患者APCs功能的缺陷等。为此， 人们试图应用负载肿瘤抗原多肽或DNA修饰DC疫苗来治疗恶性肿瘤。DC是迄今已知的体内最强的APCs， 众多证据表明DC疫苗能诱发肿瘤抗原特异性CTL 效应， 产生抗肿瘤效果。但是， 由于DC体外诱导培养以及质量控制较复杂， 成本较高， 来源受限而且长期储存困难， 难以维持持久的抗肿瘤免疫保护活性等。这些缺陷已成为DC免疫治疗的“瓶颈”。而EXO一个重要的生物学功能是介导细胞间的物质和信息交流。DC可通过释放EXO彼此间有效传递抗原， EXO作为抗原载体从外周组织传递抗原到淋巴组织， 不需要大量细胞迁移就能调节免疫， 不仅能激活CTL， 也能激活NK细胞［12］。研究显示， Dexo几乎含有DC表达的所有的抗原提呈分子， 如MHCI 和 II 类分子， CD1a、 b、 c和d以及CD86 等共刺激分子， 这使得Dexo能够通过天然杀伤细胞激发和放大天然和主动免疫反应［3］。1996年首次报道了B细胞释放的EXO诱导MHCII 限制性的抗原特异性的T细胞反应［1］。1998年Zitvogel 等［4］首次在动物模型中应用负载肿瘤抗原的Dexo使荷瘤小鼠肿瘤得以消退。这些研究显示， EXO具有潜在的免疫调节和抗肿瘤活性。Andre等研究证实Dexo能够将pMHCI 转移给其他非成熟DC并能有效激活CD8+T细胞， 这一结果提示EXO可能是DC细胞间转移传递pMHC， 并在体内诱导有效的CTL反应的机制之一［8， 13］。
　　
　　Dexo能诱导抗原特异性的抗肿瘤免疫保护。不过单用EXO诱导的抗肿瘤保护明显低于DC， 只能起到肿瘤的预防性作用， 还不能用于肿瘤的治疗， 这可能与Dexo 的免疫源性低于DC有关［3］。为此， 有必要采取一些策略来提高EXO的抗肿瘤效应。最近我们尝试了应用Dexo体外致敏DC进行抗肿瘤免疫的研究。结果显示， Dexo不仅能将其抗原提呈分子转移给DC， 同时还能将pMHCI 转移给DC。获得EXO抗原提呈分子以及pMHCI 的DC具有很强的免疫刺激活性。其免疫刺激活性， 不仅显著地高于Dexo组， 同时也高于阳性对照DCOVA组， 能够诱导100％的抗肿瘤保护［8］。在荷瘤小鼠的治疗性研究中， 这种EXO体外致敏的DC能够使87％小鼠肿瘤消退［8］。在以往的研究中， 发现CD4+ T 辅助细胞(Th)在被DC激活的过程中， 可从DC获得膜分子并能够充当抗原提呈细胞的角色刺激抗原特异性的CTL反应和诱导抗原特异性的抗肿瘤免疫［14］。在DC传递膜分子的过程中， Dexo可能充当重要的角色。为此， 最近我们在体外应用Dexo直接致敏体外激活的CD4+T 细胞（activated T cells， aT）， 并检测其所诱导的CTL反应和抗肿瘤免疫。结果显示， Dexo也能转移其所含有的抗原提呈分子以及pMHCI 给aT。 获得EXO抗原提呈分子以及pMHCI 的aTexo， 能够发挥更强的免疫刺激活性。不仅能够诱导比DC更强的抗原特异性的抗肿瘤作用以及记忆T细胞， 而且能够克服调节T细胞所介导的免疫抑制作用， 显示其较DC更强的免疫源性［15］。这一结果提示， EXO体外致敏的激活的CD4+T细胞可能是一种新型的更强的T细胞抗肿瘤疫苗，从而展现了应用EXO进行肿瘤免疫治疗的更广阔、更实用的临床应用前景。

　　4 肿瘤细胞来源的EXO在肿瘤免疫治疗中的应用
　　
　　肿瘤细胞也可释放肿瘤细胞来源的胞外体（tumor cellderived exosomes， Texo）。研究显示， Texo同样含有MHCI、 热休克蛋白、 LAMP1、 四次跨膜蛋白、 HSP7080以及TAA， 如恶性黑色素瘤Mart1分子、 酪氨酸相关蛋白、 gp100 等［3］。Texo其形态和比重密度和Dexo 相似。因此， Texo也可以象Dexo那样从肿瘤细胞培养的上清液中纯化。既然Texo中也存在肿瘤抗原运载系统(HSPs)以及与细胞靶向性有关的蛋白(CD9)， 提示Texo可能也是一种抗原传递系统， 能将肿瘤抗原转移到APCs。研究显示， 从骨髓瘤细胞系J558分离的Texo表达P1A肿瘤抗原， 能够诱导抗J558肿瘤作用， 使得80%的免疫小鼠获得抗肿瘤免疫保护［3］。同样自体及异基因含有MUC1肿瘤抗原的Texo， 能诱导CTL效应并能抑制表达MUC1肿瘤细胞的生长［3］。表达OVA抗原的淋巴瘤细胞系EG7释放的EXO表达OVA蛋白， 能够在体内诱导OVA特异性的CTL 反应和抗肿瘤免疫［16］。有趣的是， MC38细胞系（结肠癌， H2b）分泌的EXO与同源TS/A细胞（乳腺癌， H2d）释放的EXO均可同样有效地抑制TS/A肿瘤的生长。而AK7细胞（间皮瘤， H2b）EXO体外致敏的DC具有抗MC38细胞的活性， 负载了Ba/F3(白血病， H2d) EXO的DC也具有抗P518肿瘤（肥大细胞， H2d）细胞的活性。这些研究提示， Texo含有许多肿瘤细胞所共有抗原， 并能将其转移到APCs， 诱导交叉性呈递的CTL反应［17］。不过由Texo诱导的抗肿瘤免疫明显地弱于由Dexo诱导的抗肿瘤免疫作用， 这可能与Texo低表达MHCI或II类分子以及缺乏共刺激分子等有关。因此， 应用基因工程， 提高Texo表达MHCI或II类分子以及共刺激分子， 提高其免疫原性， 可能是今后Texo抗肿瘤免疫治疗的方向之一。
　　
　　另外， Texo还可从肿瘤患者恶性渗出液中分离获得。这些Texo同样也负载了抗原提呈分子MHCI、 II 类分子、热休克蛋白、 CD81分子以及相关肿瘤抗原如Her2/Neu、 Mart1、 Trp1、 gpl00 等［3］。卵巢癌腹水提取的Texo携有TAA CA125和MUC1， 可其体外致敏的自体DC， 能以MHCI 限制性方式激活肿瘤抗原特异性CTL反应。从腹水中提取的Texo致敏DC， 体外刺激外周血淋巴细胞， 可使CD3＋/CD8＋ 细胞数量增加到原来的2～12倍。可见， 恶性胸水、腹水中分离的胞外体作为非细胞瘤苗在肿瘤免疫治疗中很有潜力。

　　5 基于胞外体肿瘤免疫治疗的临床试验
　　
　　目前已有两个EXO肿瘤免疫治疗的I期临床试验分别在法国和美国完成［18， 19］。第一个临床试验是13例晚期， 无法手术切除的非小细胞肺癌NSCLC患者， 其中IIIb期4 例， IV期9 例。所有患者HLAA2 阳性， 肿瘤细胞表达MAGEA3 或A4。Dexo负载了肿瘤抗原MAGEA3、 A4、 A10以及 MAGE3DPO4肽， 将含有1.3 × 1013 MHCII 分子的Dexo 悬浮在3 mL体积的注射液中， 90％皮下注射， 10％进行皮内注射， 每周1次， 共4周。治疗期间不接受任何化疗。结果9例完成了整个疗程治疗， 所有患者均能很好地耐受治疗。仅有1～2级副反应。患者生存期52～665 d， 部分患者病情获得了稳定， 生存期比预期明显延长。1/3患者检测到针对MAGE的T细胞反应， 2/4患者NK细胞溶细胞活性明显增强。第二个临床试验是15例IIIB 和IV期的黑色素瘤患者， 肿瘤表达MAGE3肿瘤抗原。作者应用两种方式使EXO负载肿瘤抗原， 一种是应用由肿瘤抗原体外致敏的DC释放的Dexo， 另一种是Dexo在体外直接负载肿瘤抗原， 并认为后者优于前者。所有患者接受每周1次的治疗方法同前， 共4周。结果， 所有患者未发现II级以上的毒性反应(NCICTC标准)， 均能耐受治疗。其中有疗效反应的5例患者(皮肤和淋巴结病变1例部分缓解; 1例微效; 1例混合反应: 皮下淋巴结缩小但肺部病灶进展; 2例稳定)。T细胞免疫监测没有显著改变， 只是CD4 T细胞CD122分子(IL2Rβ链)在外体治疗后明显上调， 3次Dexo免疫治疗后循环血中的CD3－/CD56＋ NK细胞显著升高， 半数以上患者NK溶细胞毒作用提高。虽然临床病例较少， 治疗效果还缺乏充分依据， 但从这些临床试验中可以看出， 应用EXO治疗是可以耐受和安全的。

　　6 展望
　　
　　肿瘤免疫治疗的理想肿瘤疫苗应具备安全、 有效、 稳定等生物学特征。胞外体作为一种新型的非细胞疫苗， 其理化性质、 生物学特性均符合上述要求， 并且其免疫原性、 安全性、 以及耐受性等在一些临床前期研究中已得到初步证实。目前已有符合临床用GMP标准的胞外体生产和纯化的规程。另外， 胞外体的生物学特性比较稳定，可以长期储存， 且来源广泛。因此， 胞外体在实际使用中的可控性、可操作性和可推广性都比较好。可以克服影响DC技术发展的一些缺陷。
　　
　　尽管不同细胞来源的EXO的生理作用还不太清楚， 但是目前可以肯定的是， EXO在体内细胞之间的物质传递方面发挥着重要的作用。初步的临床研究已经证实自体Dexo可以诱导体内主动和天然免疫反应。尽管经过单纯EXO治疗获得长期生存的患者数量有限， 推测患者从这一治疗获益的结论还为时过早。作为未来的肿瘤疫苗， 必须研究采取进一步行之有效的策略， 提高EXO的抗肿瘤活性， 这些策略包括: (1)应用基因修饰的方法以提高肿瘤细胞释放的EXO免疫活性分子的表达。(2)应用体外直接负载肿瘤相关抗原的方法以提高EXO的免疫原性。(3)用EXO体外冲击致敏DC以及辅助T淋巴细胞可以进一步增强其在体内的抗肿瘤效果。(4)联合应用诸如环磷酰胺等免疫调节剂可进一步增强EXO介导的抗肿瘤效应。(5)用一些佐剂来如ODN、 CpG或Ampligen等可以替代体外培养的DC作用，在动物体内有效地辅助DEX活化T细胞［20］， 有望作为DEXs的佐剂应用于临床。
　　
　　总之， 应用胞外体的临床试验的初步结果是令人鼓舞的， 也显示了其在肿瘤治疗中良好前景。应用肿瘤细胞释放的Texo或负载肿瘤抗原DC释放的Dexo体外致敏DC或CD4+T细胞能促进肿瘤抗原的提呈， 进一步诱导和增强机体抗瘤免疫功能， 对清除恶性肿瘤治疗后体内残留肿瘤细胞， 减少肿瘤复发， 延长患者生存期， 提高生存质量具有重要意义， 值得进一步研究。

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