小鼠B7DC胞外段原核表达载体的构建及表达

　　 作者：樊燕， 江文正， 张亚丽， 闻洁君， 郝文丽， 钱旻

【摘要】 　　目的: 构建小鼠B7DC胞外段基因的原核表达载体， 并在E.coli BL21中诱导表达。方法: 从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（DC）中提取总RNA， 经RTPCR扩增B7DC胞外段， 并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中， 构建重组表达质粒pET32a(+)B7DCECD。重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后， 转化E.coli BL21， 经IPTG诱导表达目的蛋白， 并用SDSPAGE和Western blot进行检测。结果: 获得全长为582 bp的小鼠B7DC胞外段基因， 经测序证实其序列正确。SDSPAGE和Western blot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41000的B7DC胞外段蛋白。结论: 成功地构建了小鼠B7DC胞外段基因原核表达载体， 并在E.coli BL21中进行表达， 为进一步研究B7DC的功能奠定实验基础。

【关键词】 B7 DC 基因克隆 原核表达

　　[Abstract] AIM: To construct a prokaryotic expression vector for the extracellular domain of murine B7DC(B7DCECD) gene， and to express the gene in E.coli BL21. METHODS: The total RNA was extracted from murine immature bone marrowderived dendritic cells and the extracellular fragment of B7DC cDNA was amplified by RTPCR. The recombinant plasmid pET32a(+)B7DCECD was constructed by cloning the extracellular fragment of B7DC cDNA into the prokaryotic expression vector pET32a(+). After the recombinant plasmid was identified by restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing， pET32a(+)B7DCECD was transformed into E.coli BL21 through IPTG induction to express the target protein， and the protein was analyzed by SDSPAGE and Western blot. RESULTS: A 582 bp of extracellular fragment B7DC cDNA was obtained and the sequence was confirmed right by DNA sequencing. SDSPAGE and Western blot analysis showed that a protein with molecular weight of 41 000 was expressed in E.coli BL21. CONCLUSION: The extracellular fragment of B7DC is successfully cloned into pET32a (+) and expressed in E.coli BL21， which lays a foundation for the further functional research of B7DC.

　　[Keywords]B7DC; gene cloning; prokaryotic expression

　　T细胞的活化需要双信号系统: 一是TCR与抗原肽MHC复合物的相互作用; 二是共刺激分子所提供的协同刺激信号。B7家族作为惟一能从抗原提呈细胞单向传送信号至T细胞的共刺激分子[1]， 已逐渐成为当今免疫学研究的一个重点领域。B7DC（PDL2）作为B7家族的第5个成员， 是Tseng等[2]在2001年研究树突状细胞（DC）和活化的巨噬细胞基因差异表达中被发现的。鼠类的B7DC基因位于第9号染色体上， 其cDNA全长约为1700 bp， 相对分子质量（Mr）约25000， 可编码247个氨基酸。B7DC选择性表达于DC上， 骨髓和脾来源的成熟或未成熟的DC均可表达B7DC。B7DC与PD1以配体受体的形式结合， 不仅在T细胞活化的过程中提供负调节信号， 而且在自身免疫性疾病的发生、 维持机体的外周耐受和肿瘤免疫方面发挥重要的作用[2， 3]。为此， 我们构建鼠B7DC胞外段原核表达载体， 并在E.coli BL21中表达， 为今后研究B7DC的功能奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 BALB/c小鼠（6～8周龄）购自中科院上海实验动物中心。EcoRⅠ、 XhoⅠ、 T4 DNA连接酶和RTPCR试剂盒均购自TaKaRa公司。rmIL4、 rmGMCSF购自吉泰生物科技有限公司。IPTG、 细胞总RNA提取试剂盒、 DNA胶回收试剂盒均购自北京鼎国生物技术公司。DNA Ladder、 AntiHis Antibody、 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG和增强型HRPDAB底物显色试剂盒均购自北京TIANGEN公司。大肠杆菌DH5α、 BL21、 质粒载体pET32a (+)均由本实验室保存。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小鼠DC的培养及细胞总RNA的提取 小鼠骨髓来源的DC的制备按常规方法进行[4]。当骨髓细胞用rmIL4和rmGMCSF诱导分化成未成熟DC时， 离心收集细胞，按RNA抽提试剂盒介绍的方法抽提细胞总RNA， 紫外分光光度法测定其浓度和纯度后置-70℃保存。

　　1.2.2 B7DC胞外段基因的克隆 以抽提的细胞总RNA为模板， 以oligo dT(20)为引物进行反转录， 反应条件为42℃ 20 min， 99℃ 5 min， 4℃ 10 min。取逆转录产物直接用于下一步常规PCR扩增， 反应条件为95℃ 2 min， 94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 72℃ 1 min， 循环30次后， 72℃延伸10 min。根据GenBank公布的小鼠B7DC基因序列设计PCR引物（由上海生工公司合成）， 用于扩增B7DC胞外段(76～657 bp)编码基因。上游引物序列为5′GGAATTCCCTAAAGAAGTGTACACCG3′ （划线部分为EcoRⅠ酶切位点）， 下游引物序列为5′CCGCTCGAGTTAGACTTTGGGTT3′（划线部分为XhoⅠ酶切位点）。

　　1.2.3 原核表达载体pET32a(+)B7DCECD的构建 用EcoRⅠ和XhoⅠ分别酶切PCR产物与pET32a(+)质粒， 经琼脂糖凝胶回收， 将载体和目的片段用T4 DNA连接酶16℃过夜连接。转化和重组质粒的酶切鉴定按常规方法进行。将经双酶切初步鉴定正确的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序， 阳性质粒命名为pET32a(+)B7DCECD (胞外段)。

　　1.2.4 小鼠B7DC蛋白的诱导表达和SDSPAGE分析 将重组质粒pET32a(+)B7DCECD转化大肠杆菌BL21， 挑取单菌落到含有100 mg/L氨苄的3 mL LB培养基中， 37℃培养过夜。次日按1∶100转接后， 37℃培养至A600达0.6～0.8。吸取部分样品作为对照， 然后加入终浓度为1 mmol/L的IPTG， 37℃诱导培养5 h。取少量细菌离心收集菌体， 加入适量SDSPAGE上样缓冲液， 煮沸10 min， 离心取上清进行120 g/L SDSPAGE， 分析B7DC表达水平， 同时以未诱导的重组菌作为对照。

　　1.2.5 B7DC蛋白的Western blot检测 SDSPAGE分离蛋白后， 将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上， 丽春红染液预染。硝酸纤维素膜经封闭后依次与AntiHis Antibody（1∶2000）和HRP标记的羊抗小鼠IgG（1∶500）反应， HRPDAB底物显色试剂盒显色。

　　2 结果

　　2.1 B7DC胞外段的克隆 提取的DC总RNA经RTPCR扩增后， 琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增得到582 bp大小的DNA片段， 与预期结果相符(图1)。

　　2.2 重组质粒pET32a(+)B7DCECD的双酶切鉴定 重组质粒pET32a(+)B7DCECD用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后电泳结果(图2)， 重组质粒可酶切出相应大小的目的基因片段， 表明构建成功。序列分析结果表明， 质粒pET32a(+)内插入片段的碱基序列与GenBank公布的一致。

　　图1 PCR结果（略）

　　Fig 1 Result of RTPCR

　　M: DNA marker; 1: RTPCR product of extracellular fragment of murine B7DC.

　　图2 重组质粒pET32a(+)B7DCECD的酶切鉴定（略）

　　Fig 2 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pET32a(+)B7DCECD

　　M: DNA marker; 1: pET32a(+)B7DCECD/EcoR Ⅰ+Xho Ⅰ; 2: pET32a(+)B7DCECD.

　　2.3 B7DC在E.coli BL21中的表达分析 测序正确的阳性克隆转化E.coli BL21， 终浓度1 mmol/L IPTG， 37℃诱导5 h后， 对菌体总蛋白进行SDSPAGE分析， 以未诱导的重组菌、 空载体转化菌和空白菌作为阴性对照。SDSPAGE结果显示， 重组菌诱导后在Mr约41000处有一特异的蛋白条带， 同预期的目的蛋白大小一致， 表明B7DC在原核系统内得到表达(图3)。将表达菌体经超声破碎后的沉淀和上清分别加样进行SDSPAGE， 结果显示重组蛋白主要存在于沉淀中， 表明重组蛋白主要以包涵体形式存在。

　　2.4 表达产物的Western blot检测 目的蛋白经SDSPAGE分离后电转移到硝酸纤维素膜上， 分别以AntiHis Antibody和HRP标记的羊抗小鼠IgG作为一抗和二抗进行分析， 结果(图4)， 载体pET32a(+)转化菌在Mr约21000处有一特异性蛋白带， 而重组质粒转化菌在Mr 41000处一有特异性显色带出现， 表明所表达的重组蛋白是鼠B7DC蛋白。

　　图3 重组质粒pET32a(+)B7DCECD诱导表达的SDSPAGE分析（略）

　　Fig 3 SDSPAGE analysis of expression of pET32a(+)B7DCECD

　　1: E.coli BL21/pET32a (+) with 1 mmol/L IPTG induction; 2: E.coli BL21/pET32a(+)B7DCECD with 1 mmol/L IPTG induction at 37℃; 3: Protein marker; 4: E.coli BL21/pET32a(+)B7DCECD with 1 mmol/L IPTG induction at 37℃; 5: E.coli BL21/pET32a(+)B7DCECD without IPTG induction at 37℃; 6: E.coli BL21 with 1 mmol/L IPTG induction at 37℃.

　　图4 重组蛋白的Western blot检测（略）

　　Fig 4 Western blot analysis of recombinant protein

　　1: E.coli BL21/pET32a(+) with IPTG induction; 2: E.coli BL21/pET32a(+)B7DCECD with IPTG induction; 3: E.coli BL21/pET32a(+)B7DCECD without IPTG induction.

　　3 讨论
　　
　　与B7家族的其他成员相同， B7DC分子包含有V样区、 C样区、 跨膜区和一个短的胞质区尾巴。通过同源性分析发现B7DC与B7H1有显著的同源性， 即34%相同， 48%相似。Latchman等[5]通过Northern blot分析了不同组织和活化的不同抗原提呈细胞中B7H1和B7DC的mRNA的表达， 结果发现与B7H1相似， B7DCmRNA高表达于胎盘， 而低表达于脾脏、 淋巴结和胸腺。IFNγ作用下B7DC mRNA表达上调， 而在未刺激的人单核细胞中未见其表达。目前， 对于B7DC的功能仍存在着争议。人们普遍认为B7DC通过结合PD1负向调控T细胞的活化和细胞因子的分泌。如Freeman等[6]证实B7DC和B7H1通过PD1依赖的途径可以抑制T细胞的增殖。但是关于B7DC具有共刺激的功能也有所报道， 而且Liu等[7]提出， 除了PD1以外， B7DC还存在着另一个受体。此受体途径对于表达B7DC的肿瘤细胞来说， 可以增强肿瘤特异性T细胞杀伤肿瘤的作用。而且此受体是不和B7H1共用的， 这可能解释了B7DC和B7H1生物学功能存在差异的原因， 同时也缓解了B7DC不同功能的争议。
　　
　　本研究中我们在分离的小鼠骨髓细胞中加入细胞因子IL4和GMCSF， 诱导其分化为未成熟的DC。在成功克隆B7DC基因胞外段的基础上， 将其与原核表达载体pET32a (+)相连， 构建了B7DC胞外段原核表达载体pET32a(+)B7DCECD， 重组质粒经IPTG诱导后表达出了B7DC蛋白。我们参照文献[8]对该蛋白的表达条件进行优化， 发现温度、 IPTG终浓度和诱导时间对B7DC蛋白的表达量影响不大。超声破碎细菌后分别取沉淀和上清进行SDSPAGE后发现， B7DC主要以非可溶性的包涵体形式存在。 B7DC作为B7家族重要的一员， 对其功能的研究还处于起步阶段。因而克隆B7DC胞外段基因并得到其蛋白产物能为下一步继续研究其对T细胞的调控作用及抗肿瘤机制打下坚实的基础。

参考文献

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　　[3] Seo SK， Seo HM， Jeong HY， et al. Coinhibitory role of Tcellassociated B7H1 and B7DC in the Tcell immune response[J]. Immunol lett， 2005， 102(2): 222-228.

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　　[8] 李 珊， 潘 全， 李云龙， 等. 人Cyclin E原核表达载体的构建及表达[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(1): 92-93.