人ERβ AF1融合蛋白的表达及其多克隆抗体制备

　　作者：袁斌， 仇玮祎△， 李杰之， 丁丽华， 韩聚强， 熊志红， 杨智洪， 叶棋浓

【摘要】 　　目的: 制备雌激素受体β多克隆抗体。方法: 从人乳腺cDNA文库中PCR扩增ERβ AF1结构域（1～144位氨基酸）， DNA 重组插入原核表达质粒pGEXKG， 转化大肠杆菌DH5α， 异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GSTERβ AF1融合蛋白。纯化后免疫BALB/c小鼠， 制备鼠多抗血清。通过Western blot和免疫组织化学实验鉴定血清特异性和效价。结果: 成功构建了pGEXKG/ERβ AF1原核表达载体， 转化DH5α后可高效表达融合蛋白GSTERβ AF1， 免疫产生的ERβ多抗可特异检测ERβ真核表达载体转染人293T细胞及乳腺癌细胞中ERβ的表达。结论: 制备的ER 抗体对ERβ有反应原性， 效价高， 特异性好， 为进一步研究ERβ的生物学功能奠定基础。

【关键词】 雌激素受体β 融合蛋白 多克隆抗体

　　1996年， Kuiper等[1]从人睾丸和大鼠前列腺组织中克隆出一种新型雌激素受体ERβ， 与ERα一样， ERβ属于核受体超家族成员， 是一类配体调节的转录因子[2]。人ERβ（hERβ）基因位于14q22-24[3]， 由530个氨基酸组成， 相对分子质量(Mr)约为60000， 其一级结构由N端到C端， 可分为A/B区(转录调控区)、 C区(DNA结合区)、 D区(多变铰链区)、 E/F区(配体结合区)等6个功能区[4]。ERβ与ERα相比肽链较短， 但其氨基酸序列在DNA结合区和配体结合区与ERα有高度同源性， 分别达96%和60%， 在活性功能区AF1和AF2同源性很低[5]。在分子水平上， ERβ通过经典的ERE途径、 AP1和Sp1位点等[6]， 与内源性配体（如雌激素）或其他配体（如抗雌激素和植物雌激素）发生反应， 进而调节一系列靶基因， 调控靶组织（器官）某些正常生理功能的发挥（如维持骨密度， 生殖器官的发育）和某些肿瘤（如乳腺癌、 卵巢癌、 子宫内膜癌）的发生、 发展过程。由于多种肿瘤中都有ERβ的表达， 且共表达水平降低， 因此ERβ极有可能成为一种新型肿瘤分子标记， 有助于临床肿瘤的早期诊断。由于ERβ在正常生理及病理过程中均起到重要作用， 因此对ERβ功能的深入研究具有十分重要的意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 克隆载体pGEXKG、 pcDNA3FLAGERβ重组质粒、 E.coli DH5α均为本实验室保存。抗FLAG的单克隆抗体(mAb)均购自Sigma公司; 辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗鼠IgG购自Vector公司; SP试剂盒购自北京中山公司; 限制性内切酶BamH I和Xho I购自NEB公司; 高保真pfu DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶及IPTG购自Promega公司; 质粒提取试剂盒(包括小量提取、 大量制备2种)购自Qiagen公司; DNA胶回收试剂盒及PCR产物回收试剂盒购自Promega公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组质粒的构建 以乳腺cDNA文库(Clontech)为模板， 以P1(5′CG GGA TCC ATG GAT ATA AAA AAC TCA CCA3′)和P2(5′CCG CTC GAG CTA CCT CTT TGA ACC TGG ACC3′)为引物， PCR扩增编码1～144位氨基酸的ER 片段。以BamH I和Xho I双酶切PCR产物， 将PCR产物插入到同样双酶切的pGEXKG载体中， 即得重组质粒pGSTERβ(1～144位氨基酸， aa)。上述克隆所用PCR扩增条件为: 94℃变性3 min后， 按以下参数进行30次循环: 94℃变性30 s， 58℃复性30 s， 72℃延伸1 min。最后72℃延伸7 min。PCR扩增所用酶为pfu DNA聚合酶。重组质粒经载体上的通用引物测序。

　　1.2.2 GST融合蛋白的诱导表达及纯化 将上述构建的表达GST的融合蛋白的重组质粒和表达GST的空载体pGEXKG转化到E.coli DH5α中。转化于37℃振荡过夜， 再按2%的接种量转接， 30℃培养6 h后， 加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L， 20℃继续诱导培养过夜。收集上述诱导菌， 用谷胱甘肽Sepharose 4B小颗粒纯化GST融合蛋白， 基本按Pharmacia公司提供的方法进行， 即按10∶1 (V/V)的比例加入细胞裂解液(50 mmol/L TrisHCl pH7.5、 150 mmol/L NaCl、 1 mmol/L EDTA、 0.3 mmol/L DTT、 1 g/L NP40及蛋白酶抑制剂)， 超声破碎， 离心收集上清液， 加入适量谷胱甘肽Sepharose 4B小颗粒， 结合3 h。再收集谷胱甘肽Sepharose 4B小颗粒， 用细胞裂解液充分洗去未结合蛋白质后， 即得到结合有GSTERβ(1～144位氨基酸)融合蛋白或GST蛋白的谷胱甘肽Sepharose 4B小颗粒。

　　1.2.3 多克隆抗体的制备 将纯化的GSTERβ(1～144 aa)融合蛋白与福氏完全佐剂1∶1混匀后， 皮下多点注射BALB/c小鼠， 初次免疫后每3周使用不完全弗氏佐剂加强免疫1次， 末次免疫后第10天眼球取血， 免疫血清于-70℃保存[7]。

　　1.2.4 哺乳动物细胞的转染 用无双抗的DMEM培养基(含100 mL/L FBS)将293T细胞接种在12孔板中。接种后24 h， 将总量为2.0 μg DNA与80 μL DMEM培养基混合， 再将2.5 μL Lipofectamine 2000与80 μL DMEM培养基混合， 然后将上述2种溶液混合， 室温放置15 min， 加入到细胞中。

　　1.2.5 Western blot检测 293T细胞转染24 h后， 收集细胞， 加入SDS上样缓冲液， 煮沸10 min， 离心后取上清液进行SDSPAGE后电转移至硝酸纤维素膜上， 分别用自制免疫血清和抗FLAG抗体进行Western blot检测。用自制免疫血清进行Western blot检测时， 用100 g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜， 加入用50 g/L脱脂奶粉1∶1000稀释的免疫血清， 室温轻摇1 h， TBST洗膜3次， 每次10 min， 加入用50 g/L脱脂奶粉稀释的HRP偶联的羊抗鼠IgG， 室温轻摇1 h， TBST洗膜3次， 每次7 min， 用化学发光法显色5 min， 压片显影。用FLAG抗体进行Western blot检测时， 用50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h， 加入用50 g/L脱脂奶粉1∶5000稀释的FLAG抗体， 室温轻摇1 h， TBST洗膜3次， 每次7 min， 加入用50 g/L脱脂奶粉稀释的HRP偶联的羊抗鼠IgG， 室温轻摇1 h， TBST洗膜3次， 每次7 min， 用化学发光法显色5 min， 压片显影。

　　1.2.6 ERβ在不同乳腺癌细胞株中的表达 收集人乳腺癌细胞株MCF7、 MDMBA435、 ZR751、 MDMBA231、 MDMBA453和T47D， 分别加入1 mL冰预冷的RIPA缓冲液， 冰上超声1 s， 10000 r/min离心10 min， 既得到细胞样品。加入等体积的2×SDS上样缓冲液， 煮沸10 min， 12000 r/min离心1 min， 取上清。Western blot检测收集的293T细胞蛋白为对照。

　　1.2.7 乳腺癌组织中ERβ的表达 收集经乳腺癌根治术或改良根治术的手术标本， 均经病理证实为乳腺癌， 以癌旁组织为对照， 蜡块保存良好的病例进行研究。

　　2 结果

　　2.1 人ERβ基因5′端430 bp片段的克隆和表达载体的构建 以P1、 P2为引物， PCR扩增获得一条约430 bp的条带， 与目的片段大小相近(图1)。PCR产物插入pGEXKG载体， 转化菌质粒用BamH I和Xho I酶切可切下约430 bp片段。DNA序列分析表明质粒为ERβ基因的克隆， 序列与GenBank报道序列完全一致。

　　2.2 GSTERβ融合蛋白在大肠杆菌中的表达 将重组质粒pGSTERβ(1～144 aa)转化到E.coli DH5α中， 转化菌经IPTG诱导后进行SDSPAGE。结果表明(图2)， 与阴性对照DH5α相比， DH5α(pGEXKG)特异地表达了Mr约为29000的GST蛋白， 而DH5α(pGSTERβ(1～144 aa))特异地表达了Mr约为45000的预期蛋白， 说明GSTERβ AF1融合蛋白的构建及表达获得成功。

　　图1 ERβ AF1 PCR产物的琼脂糖电泳鉴定（略）

　　M: DL 2000 marker; 1: 阴性对照; 2: ERβ AF1 PCR产物.

　　图2 E.coli DH5α中表达ERβ(1～144 aa)（略）

　　M: 蛋白marker; 1: 阴性对照(IPTG诱导GST蛋白); 2: IPTG诱导表达GSTERβ AF1融合蛋白.

　　2.3 GSTERβ融合蛋白的纯化 GSTERβ(1～144位氨基酸)融合蛋白在大肠杆菌中经低温诱导表达后， 获得了较大量的可溶性蛋白。这些可溶性蛋白经谷胱甘肽Sepharose 4B小颗粒亲和层析后进行SDSPAGE。结果表明(图3)， GSTERβ(1～144位氨基酸)和GST分别为纯的单一蛋白条带。

　　图3 GSTERβ AF1重组蛋白在大肠杆菌中的纯化（略）

　　M: 蛋白marker; 1: 纯化的GST蛋白; 2: 纯化的GSTERβ AF1融合蛋白.

　　2.4 ERβ在哺乳动物细胞中的表达及多克隆抗体的鉴定 为了便于ERβ抗体特异性的验证， 以带有FLAG标签的ERβ蛋白作为对照， 将pcDNA3FLAGERβ重组质粒转染293T细胞， 收集细胞总蛋白质进行SDSPAGE， 用抗FLAG抗体进行Western blot分析。结果表明， 转染pcDNA3FLAGERβ的293T细胞表达了Mr约为58000的FLAGERβ蛋白， 而293T细胞无蛋白质条带， 与预期结果相同(图4)。用自制免疫血清进行Western blot分析， 结果表明， 转染ERβ重组质粒的293T细胞可以检测到Mr正确的蛋白条带， 且条带位置与用FLAG抗体检测的条带的位置相同(图4)， 而293T细胞未检测到任何条带， 说明293T细胞无内源性ER。这些结果说明制备的多克隆抗体能特异地与ERβ蛋白反应。

　　图4 Western blot检测ERβ抗体的特异性（略）

　　1: 转染pcDNA3FLAG空载体的293T细胞; 2: 转染pcDNA3FLAGERβ的293T细胞.

　　2.5 ERβ在不同乳腺癌细胞株中的表达 提取人乳腺癌MCF7、 MDMBA435、 ZR751、 MDMBA231、 MDMBA453和T47D细胞总蛋白， 蛋白定量， 调整蛋白浓度， 进行SDSPAGE， 抗ERβ抗体进行Westrern blot分析各组织中ERβ表达情况， 同时用抗GADPH抗体Westrern blot分析作为内参。结果(图5)在不同的乳腺癌细胞中都有ERβ表达， 说明ERβ在体内分布广泛。

　　图5 Western blot检测ERβ在乳腺癌细胞株中的表达（略）

　　1: ZR751; 2: MDMBA435; 3: MCF7; 4: MDMBA231; 5: MDMBA453; 6: T47D; 7: 阳性对照(转染pcDNA3FLAGERβ的293T细胞).

　　2.6 ERβ在乳腺癌组织标本中的表达 免疫组织化学检测乳腺癌组织标本表明， ERβ主要在导管和小叶上皮细胞核内有不同程度的表达。在胞质内也有少量至中度ERβ表达（图6）。

　　图6 免疫组织化学检测ERβ在乳腺癌组织中的表达（×400）（略）

　　A: 免疫前血清; B: 免疫后血清.

　　3 讨论
　　
　　尽管越来越多的证据表明， ERβ在生理和病理过程中均起重要作用， 但目前商业化的ERβ抗体大多存在效价低和特异性差而不能进行深入研究。为了获得特异性针对ERβ有反应原性的抗体， 我们选取ERβ的AF1结构域(1～144 aa)为抗原区。本研究中采用pGEXKG原核表达载体， 对于表达、 纯化和检测大肠杆菌表达的融合蛋白是有用的工具。pGEXKG带有非常强的T7启动子、 终止子和抗Amp基因， 其本身表达Mr约29000的GST蛋白， 该系统可以克服转录与转录后水平对外源基因表达可能带来的不利影响， 便于融合基因翻译起始， 是一种高效的蛋白表达载体， 并可用商品化的谷胱苷肽琼脂糖通过亲和层析方便地从细菌裂解物中纯化蛋白， 获得的蛋白适合抗体和疫苗的制备。为了鉴定所得抗体的特异性， 我们将ERβ的编码序列克隆到带有FLAG标签的真核表达载体中， 使其在哺乳动物细胞中表达， 并用抗FLAG抗体和自制的免疫血清进行比较鉴定。以上的结果都表明免疫血清对ERβ蛋白的良好特异性。通过对不同乳腺癌细胞株的表达检测， 我们发现ERβ的分布具有广泛性。近几年ERβ蛋白水平的检测结果， 表明乳腺癌中ERβ蛋白表达阳性可能是预后良好的指标， 但还需进一步研究和大样本临床随访[8]。
　　
　　在抗原抗体相互作用基础上发展起来的一系列技术， 如免疫共沉淀、 Western blot检测和免疫组织化学等， 在蛋白质的检测和功能研究中都有着广泛的应用。制备高效价的抗体是研究基因表达和功能的重要工具。mAb具有特异性、 性质稳定和重复性好的特点， 但它制备复杂， 费时费力， 且存在局限性。制备小鼠多克隆抗体具有简单、 快速和效果好等优点。本研究中成功制备了特异性高和效价良好的抗ERβ多克隆抗体， 并可用于Western blot分析和免疫组织化学研究， 为今后深入研究ERβ的表达分布、 细胞内定位及与其他蛋白质间相互作用奠定了良好的基础。

参考文献

　　[1] Kuiper GG， Enmark E， PeltoHuikko， et al. Cloning of a novel receptor expressed in rat prostate and ovary[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1996， 93(12): 5925-5930.

　　[2] Knowlden JM， Gee JM， Robertson JF， et al. A possible pergent role for the oestrogen receptor α and β subtypes in clinical breast cancer[J]. Int J Cancer， 2000， 89(2): 209-212.

　　[3] Enmark E， PeltoHuikko， Grandien K， et al. Human estrogen receptor β gene structure， chromosomal localization， and expression pattern[J]. J Clin Endocrinol Metab， 1997， 82(12): 4258-4265.

　　[4] Kumar V， Green S， Stack G， et al. Functional domains of the human estrogen receptor[J]. Cell， 1987， 51(6): 941-951.

　　[5] Speirs V， Carder PJ， Lane S， et al. Oestrogen receptor beta: what itmeans for patients with breast cancer[J]. Lancet Oncol， 2004， 5(3): 174-181.

　　[6] Paech K， Webb P， Kuiper GG， et al. Differential ligand activation of estrogen receptors ERα and ERβ at AP1 sites[J]. Science， 1997， 277(5331): 1508-1510.

　　[7] 丁丽华， 袁 斌， 严景华， 等. FHL1抗体的制备和鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(6): 804-806.

　　[8] Hopp TA， Weiss HL， Parra IS， et al. Low levels of estrogen receptor beta protein predict resistance to tamoxifen therapy in breast cancer[J]. Clin Cancer Res， 2004， 10(22): 7490-7499.