雷公藤在大鼠1型糖尿病模型中对调节性T细胞Foxp3表达的影响及意义

【摘要】 　　目的: 研究雷公藤在大鼠1型糖尿病模型中对CD4+CD25+调节性T细胞（Tr）Foxp3基因表达的影响及意义。方法: 将48只大鼠随机分为3组， 每组各16只， Ⅱ、 Ⅲ组采用小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法制备大鼠1型糖尿病模型， Ⅰ组为正常对照。Ⅲ组在成模后给与雷公藤多甙（GTT）灌胃， 1次/d， 连续3个月。淋巴细胞转化试验（MTT法）检测脾淋巴细胞增殖活性; 荧光定量PCR检测外周血及脾淋巴细胞Foxp3 mRNA的表达; 免疫组化检测淋巴结和脾组织FOXP3蛋白的表达。结果: Ⅱ、 Ⅲ组血糖水平高于Ⅰ组（P&<0.01）; 胰岛中Ⅲ组淋巴细胞浸润程度较Ⅱ组减轻; Ⅱ、 Ⅲ组淋巴细胞增殖活性均较Ⅰ组升高（P&<0.01）， 用药后Ⅲ组较Ⅱ组降低; Foxp3 mRNA、 FOXP3蛋白表达水平Ⅱ、 Ⅲ组均高于Ⅰ组（P&<0.05）， Ⅲ组表达水平较Ⅱ组有所升高， 但差别无统计学意义（P&>0.05）。结论: Foxp3+Tr细胞参与了STZ诱导的大鼠1型糖尿病的发生发展; 上调Tr细胞Foxp3基因的表达可能为雷公藤治疗1型糖尿病的机制之一。

【关键词】 CD4+CD25+调节性T细胞 Foxp3 雷公藤 1型糖尿病

　　[Abstract] AIM: To investigate the significance and effect of Glucosidorum Tripterygii tororum (GTT) on the expressions of Foxp3 in CD4+CD25+ regulatory T cells（Tr） in type 1 diabetic rat model. METHODS: 48 rats were pided evenly into 3 groups by random. Diabetic model was developed by multiple low dose intraperitoneal injection of streptozotocin in groupⅡ， Ⅲ， and groupⅠwas treated as normal control. After the establishment of the model， administration of GTT was conducted in group Ⅲ， which was performed once a day， lasting three monthes. Lymphocyte proliferation was detected by lymphocyte transformation test（MTT assay）. The expression of Foxp3 mRNA was measured in peripheral blood and spleen by using realtime PCR. The expression of Foxp3 protein in lymphoid node and spleen was detected by immunohistochemistry. RESULTS: The blood glucose level in group Ⅱ， Ⅲ was obviously higher than that of control group（P&<0.01）， followed with lymphocyte infiltrating in pancreatic islets. The infiltrating degree in group Ⅲ was decreased than that of groupⅡ. The proliferation of splenic lymphocyte in group Ⅱ， Ⅲ was evidently increased comparing with the control group (P&<0.01). After administration of GTT， the proliferation in group Ⅲ was lower than that in group Ⅱ. In groupⅡ， Ⅲ， the expressions of Foxp3 mRNA and protein increased markedly compared with control group（P&<0.05）. Moreover， the level in group Ⅲ was especially enhanced， but compared with group Ⅱ， there was no significantly difference (P&>0.05). CONCLUSION: Foxp3+ Tr may involve in the pathogenesy of type 1 diabetes indused by STZ. GTT did have therapeutical effect on type 1 diabetes， possibly through upregulating the expressions of Foxp3 in Tr.

　　[Keywords]CD4+CD25+ regulatory T cells; Foxp3; Glucosidorum Tripterygii tororum; Type 1 diabetes

　　1型糖尿病是一种由T细胞介导的胰岛β细胞选择性破坏、 胰岛素分泌绝对减少为特征的自身免疫性疾病， 其病因和发病机制尚未完全阐明。CD4+CD25+调节性T细胞（CD4+CD25+ regulatory T cells， Tr）是机体一类重要的T细胞亚群， 参与体内负向免疫调节， 在自身免疫性疾病的发生和发展中具有重要作用[1]。Foxp3是叉头样转录因子（forkhead transcription factor）家族中的成员， 其编码基因Foxp3是Tr细胞生长发育及发挥功能的关键基因[2] 。研究证实[3]Tr细胞高表达Foxp3， 可作为检测Tr细胞一个特异性的指标。雷公藤多甙（Glucosidorum Tripterygii tororum， GTT）是植物雷公藤提取物， 具有较强的抗炎和免疫抑制作用， 实验证明它既影响体液免疫又作用于细胞免疫， 从多个环节抑制免疫应答过程[4] 。目前有关雷公藤多甙用于1型糖尿病的实验研究甚少。有报道GTT对链脲佐菌素诱导的糖尿病鼠α、 β细胞具有保护作用， 但其体内作用机制是否与Foxp3+Tr细胞有关， 目前国内外尚无相关报道。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 清洁级Wistar雄性大鼠(体质量180～220g， 共48只)由青岛市药检所提供。STZ（Sigma 公司）， TRIzol（Ivitrogen 公司）， 淋巴细胞分离液（上海试剂二厂）， PrimeScript RTPCR试剂盒（TaKaRa Code: DRR061S）， Foxp3单克隆抗体（mAb）（eBioscence）， 二抗（北京中山）， 雷公藤多甙（湖南株州制药三厂）， 微量血糖测定仪（美国强生稳豪）， 尿糖试纸（长春迪瑞实业有限公司）， 荧光定量PCR仪（美国ABI 7500）。刀豆蛋白ConA （美国 Sigma公司）; MTT（美国 Amresco公司）; RPMI1640干粉培养基（美国Gibco公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 大鼠1型糖尿病模型的建立 将48只Wistar大鼠随机分为3组， 每组16只， 观察大鼠健康状况， 1周内饮食正常、 体质量不减， 血糖， 尿糖含量正常者即可用于实验。福氏佐剂（CFA）按4∶1称取液体石蜡和羊毛脂， 研碎混匀后分装， 高压消毒后低温保存， 使用前按3 g/L加入无菌灭活卡介苗， 进行无菌乳化后使用。将STZ用0.1 mol/L无菌枸橼酸钠缓冲液新鲜配制成2%溶液， 调节pH至4.5， 滤菌器过滤除菌备用。各组大鼠均腹腔注射CFA， 0.5 mL/只。注射CFA后第2天， Ⅱ、 Ⅲ组大鼠腹腔注射STZ溶液， 25 mg/kg， Ⅰ组大鼠腹腔注射等体积0.1 mol/L的枸橼酸钠溶液。每周1次， 连续3周重复上述步骤。每次注射STZ后均测定血糖和尿糖， 成模标准参照文献[5]。成模后Ⅲ组给予雷公藤多甙15 mg/（kg·d）灌胃， Ⅱ组（糖尿病对照组）和Ⅰ组（正常对照组）给与生理盐水灌胃， 连续3个月， 每隔1个月处死一批做下述检测。

　　1.2.2 大鼠胰腺病理变化的观察 大鼠麻醉后取胰腺， 40g/L多聚甲醛固定后， 依次进行系列梯度脱水、 浸蜡、 包埋及切片， 按常规进行HE染色， 光镜下观察结果。

　　1.2.3 脾淋巴细胞增殖试验（MTT法） 制取脾单个核细胞悬液， 计数， 调整细胞密度至1×106， 取细胞悬液100 μL接种到96孔板中， 同时加入终浓度5 mg/L的ConA（对照组不加）， 每组设3复孔， 37℃、 50 mL/L CO2培养箱中孵育72 h后， 每孔加入20 μL MTT溶液（5 g/L）， 继续培养4 h， 离心， 加入150 μL DMSO， 充分振荡后在酶标仪上570 nm处测A值， 计算刺激指数: SI=试验孔A值/对照孔A值。

　　1.2.4 荧光定量PCR检测Foxp3 mRNA表达 大鼠水合氯醛麻醉， 心内取血5 mL， EDTA抗凝。无菌取脾（剪成2块， 一块用于做石蜡切片， 一块制成脾细胞悬液）， 密度梯度离心法分离外周血及脾细胞悬液中单个核细胞， 利用TRIzol一步法提取单个核细胞总RNA， 取总RNA 1 μg进行逆转录反应合成cDNA， 采用两步法进行PCR扩增， 终体积20 μL， 引物（上海生工技术服务有限公司）: Foxp3 F: 5′GCTGGAGCTGGAAAAGGAGAA3′， R: 5′GCAGGAGCTCTTGTCCACTGA3′， Taqman探针: 5′FAMCCACCTGGCTGGGAAGATGGCATTTAMRA3′（产物为106 bp）， GAPDH引物F: 5′TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT3′， R: 5′CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC3′， Taqman探针: 5′FAMCCACGGCAAGTTCAACGGCACAGTTAMRA3′（产物为134 bp）。PCR反应条件: 95℃ 10 s， 95℃ 5 s， 60℃ 45 s， 40个循环。每个样本均重复3复孔， 取平均值， Foxp3和GAPDH分别在两个管中同时进行反应， 结果经内参均一化处理后， 以对照组任一例目的基因表达量为参照因子， 采用2-△△CT法进行分析。

　　1.2.5 免疫组化检测FOXP3蛋白 将石蜡包埋的淋巴结、 脾组织切成4 μm厚的切片， 脱蜡至水， 经消除内源性过氧化物酶及抗原复性处理后， 进行免疫组化染色。染色参照免疫组化二步法试剂盒说明书操作， 苏木素复染后封片。

　　1.2.6 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件。数据以x±s表示， 组间比较采用F检验及SNKq检验。P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 大鼠成模率和血糖的检测 Ⅱ组分别于注射STZ后1周， 2周各死亡1只， 成模12只; Ⅲ组于第2周死亡1只， 成模14只， 总成模率86.21%。成模后Ⅱ、 Ⅲ组血糖均较Ⅰ组升高（P&<0.01）， 尿糖+++～++++， 此后3个月一直维持在高水平。Ⅲ组给药1、 2、 3个月后血糖水平较同期Ⅱ组有所降低， 但差别无统计学意义（P&>0.05， 表1）。

　　表1 大鼠成模前后血糖水平（略）

　　Tab 1 Blood glucose concentration of rats before and after injection of STZ

　　bP&<0.01 vs before establishment of model.

　　2.2 大鼠胰腺病理变化的观察 HE染色结果显示Ⅱ、 Ⅲ组大鼠的胰岛细胞核肿胀、 崩解， 胰岛细胞数减少， 纤维组织增生， 胰腺间质及胰岛中可见以淋巴细胞和单核细胞为主的炎细胞浸润; Ⅱ组胰岛尚可见β细胞明显空泡变性、 坏死， 使胰岛呈空虚状态。Ⅲ组在给药2个月后炎细胞浸润程度较Ⅱ组减轻， 3个月后减轻更加明显。

　　2.3 脾淋巴细胞增殖活性检测 与Ⅰ组比较， Ⅱ、 Ⅲ组脾淋巴细胞增殖能力增强（P&<0.01， 图1）。用药后3个月中Ⅲ组呈下降趋势， Ⅱ组持续在高水平。Ⅲ组在用药1、 2个月后SI较同期Ⅱ组有所降低， 但差别无统计学意义， 用药3个月后降低明显（F=292.073， P&<0.05）。

　　图1 淋巴细胞增殖活性检测（略）

　　Fig 1 The detectin of lymphocyte proliferation

　　aP&<0.05 vs groupⅡ， bP&<0.01 vs groupⅠ.

　　2.4 外周血和脾脏Foxp3 mRNA的表达 Ⅱ、 Ⅲ组在成模1、 2、 3个月后外周血中(图2) Foxp3 mRNA水平均较Ⅰ组升高（1月 F=5.016， P=0.034， 2月 F=6.984， P=0.015， 3月 F=12.225， P=0.003）， Ⅱ、 Ⅲ组在成模1、 2、 3个月后脾中(图3) Foxp3 mRNA表达水平均较Ⅰ组升高（1月 F=17.109， P=0.001， 2月 F=7.921， P=0.010， 3月 F=13.324， P=0.002）， 其中， Ⅲ组表达水平较Ⅱ组进一步升高（2、 3月后升高明显）， 但差别无统计学意义（P&>0.05）。3个月中(图4)， Ⅰ组组间无明显变化， Ⅲ组血和脾Foxp3 mRNA表达水平呈升高趋势， 而Ⅱ组呈降低趋势。

　　图2 血中Foxp3mRNA水平（略）

　　Fig 2 The level of Foxp3 in blood

　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs groupⅠ.

　　图3 脾中Foxp3 mRNA水平（略）

　　Fig 3 The level of Foxp3 in spleen

　　bP&<0.01 vs groupⅠ.

　　2.5 免疫组化染色结果 Foxp3基因表达产物FOXP3蛋白为一种转录因子， 定位于细胞核， 淋巴结染色结果（图5）阳性细胞弥散分布于淋巴结深皮质区， 脾染色结果（图6）阳性细胞主要集中于动脉周围淋巴鞘附近， 白髓与红髓交界的边缘区也有散在分布。淋巴结与脾中均可见Ⅱ、 Ⅲ组阳性细胞数较Ⅰ组增加， 其中， Ⅲ组用药1月后染色与Ⅱ组无明显差异， 用药2、 3个月后染色较Ⅱ组明显增强。

　　图4 血和脾3个月中Foxp3表达水平比较（略）

　　Fig 4 Comparison of Foxp3 in blood and spleen

　　图5 淋巴结Foxp3表达（略）

　　Fig 5 TheexpressionofFoxp3inlymphoidnode(IHCstain，×400)

　　A: Group Ⅰ; B: Group Ⅱ; C: Group Ⅲ （1 month after treatment）; D: Group Ⅲ（2 monthes after treatment）; E: Group Ⅲ（3 monthes after treatment）; F: Negative control.

　　图6 脾中Foxp3表达（略）

　　Fig 6 The expression of Foxp3 in spleen （IHC stain， ×400）

　　A: Group Ⅰ; B: Group Ⅱ; C: Group Ⅲ （1 month after treatment）; D: Group Ⅲ（2 monthes after treatment）; E: Group Ⅲ（3 monthes after treatment）; F: Negative control.
　
　　3 讨论
　　
　　近年来调控免疫反应的CD4+CD25+Tr细胞成为免疫抑制治疗的研究焦点。Foxp3基因的表达产物FOXP3为转录因子，　　有着调控CD4+CD25+Tr细胞发育及功能的作用[6]。Foxp3在鼠特异性表达于CD4+CD25+Tr细胞， Morgan等[7]研究发现， 人类的Foxp3除表达于Tr细胞。还表达于刺激后的CD25-和CD8+T细胞， 表达Foxp3的T细胞均具有免疫抑制作用。目前已有多项研究证明多种自身免疫性疾病（如幼年特发性关节炎、 成人T细胞白血病和银屑病等）Foxp3表达降低， 而对1型糖尿病， Foxp3表达的相关报道尚不一致。本研究中我们采用STZ和CFA联合注射制备大鼠1型糖尿病模型， 其造模的机制为: 注射CFA后激活大鼠体内T淋巴细胞， 注射小剂量STZ后诱导胰岛β细胞发生轻度改变， 这样被激活的T淋巴细胞将轻度改变的胰岛β细胞当作靶细胞进行攻击， 经过3周的不断强化， 从而导致自身免疫过程的发生， 出现一系列临床症状。本研究结果表明: 成模后Ⅱ组糖尿病鼠T淋巴细胞Foxp3表达量较正常鼠增加， 这是因为在造模过程中， 随着T淋巴细胞的激活， Tr细胞的活性也相应地上调， 表现为Foxp3表达的增加， 但终因T淋巴细胞的大量活化， Tr的相对不足， 体内免疫平衡系统破坏， 导致糖尿病进一步向纵深发展。但随着时间的推移， 造模后1、 2、 3个月， Ⅱ组糖尿病鼠Tr细胞的活性在不断下调， 表现为Foxp3表达呈下降趋势， 而Ⅲ组3个月中表达水平呈上升趋势。
　　
　　本研究中胰腺HE染色结果表明雷公藤使胰腺炎性细胞浸润程度较糖尿病对照组明显减轻， 这与李玲等[8]的研究结果相一致。淋巴细胞增殖试验亦证明其对淋巴细胞的增殖有一定的抑制作用， 并随着用药时间的延长， 增殖活性呈下降趋势。同时， 雷公藤治疗后， 大鼠血糖水平较对照组有所降低， 但差别无统计学意义， 说明该药物虽然在一定程度上能抑制淋巴细胞增殖， 改善胰腺炎症情况， 但在很大程度上并不能逆转T淋巴细胞对胰岛β细胞的损害及由此引起的胰岛素水平的绝对不足。本研究中荧光定量PCR和免疫组化结果表明: 用药组Foxp3表达量较糖尿病对照组进一步升高，　　脾中表达改变较外周血中显著， 并且随着用药时间的延长， 升高更加明显， 但差别无统计学意义。因此， 上调Foxp3+Tr细胞活性或数量是否为雷公藤实现其抑制作用的机制之一尚需扩大样本数量进一步的研究证实。

参考文献

　　[1] Fehervari Z， Sakaguchi S. Development and function of CD25+CD4+ regulatory T cells[J]. Curr Opin Immunol， 2004， 16(2): 203-208.

　　[2] Hori S， Sakaguchi S. FOXP3: A critical regulator of the development and function of regulatory T cells[J]. Microbes Infect， 2004， 6(8): 745-751.

　　[3] 杨江华， 张永祥， 王 芳， 等. 人外周血CD4+CD25+调节性T细胞的分离、 鉴定和功能特征[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(2): 252-254.

　　[4] 冯继明， 燕 敏， 安增梅， 等. 雷公藤多甙对成人隐匿性自身免疫性糖尿病患者谷氨酸脱羧酶抗体和细胞功能的影响[J]. 中国医药， 2006， 1(8): 468-470.

　　[5] 于德民， 吴 锐， 尹 潍， 等. 实验性链脲佐菌素糖尿病动物模型的研究[J]. 中华糖尿病杂志， 1995， 3(2): 105-109.

　　[6] Fontenot JD， Gavin MA， Rudensky AY， et al. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J]. Nat Immunol， 2003， 4(4): 330-336.

　　[7] Morgan ME， Jolanda HM， Bilsen V， et al. Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humansm[J]. Human Immun， 2005， 66(1): 13-20.

　　[8] 李 玲， 涌上民雄， 腾卫平， 等. 雷公藤甲素对糖尿病小鼠胰岛炎的免疫抑制效果及对正常小鼠糖代谢的影响[J]. 中国糖尿病杂志， 1994， 2(2): 69-75.