小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达

　　　　作者：李娜， 朱道银， 帖儒修， 王瑜伟

【摘要】 　　目的: 构建小鼠胞内病原体抗性基因1（Ipr1）基因与EGFP基因融合表达载体， 观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达。方法: 从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA， 以RTPCR法调取Ipr1基因编码序列， 克隆至pEGFPC1载体中， 筛选阳性克隆作PCR、 酶切及测序鉴定后得到pEGFPIpr1， 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7， 以空质粒pEGFPC1转染组作为对照。采用RTPCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。结果: 扩增出小鼠Ipr1基因编码序列， 经PCR、 酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFPIpr1， 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达， Ipr1基因表达产物定位于细胞核内。结论: 成功地调取小鼠Ipr1基因， 构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7得到了成功表达。Ipr1编码蛋白定位于细胞核内， 提示其是一种调节蛋白。

【关键词】 Ipr1基因 结核病 绿色荧光蛋白 定位

　　[Abstract]AIM: To construct an eukaryotic expression vector containing the fusion gene of mouse Ipr1 and EGFP and to study its expression in murine macrophage RAW264.7. METHODS: The coding sequence of Ipr1 gene was amplified from the total RNA of C57BL/6J mouse thymus by RTPCR. The gene was cloned into pEGFPC1 and the recombinant plasmid was identified by PCR， restrict endonuclease digestion and sequencing. Then the pEGFPIpr1 was transiently transfected into RAW264.7. The expression of Ipr1 gene and fusion protein was detected by RTPCR and laser scanning confocal microscopy. RESULTS: The whole coding sequence of Ipr1 was successfully amplified. The recombinant plasmid was identified by PCR， restrict endonuclease digestion and sequencing. The fusion protein was successfully expressed in the targeted cells and its localization was in nucleus. CONCLUSION: The eukaryotic expression vector pEGFPIpr1 has been successfully constructed. The fusion protein can be expressed in murine macrophage RAW264.7 and located in nucleus.

　　[Keywords]Ipr1 gene; tuberculosis; pEGFPC1; location

　　结核病位居单一病原体引起患者死亡的传染病之首， 全球每年死亡200余万人。我国属结核病高负担国家， 结核病感染人数居全球第二。感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）的人中仅10%的人发展为结核病，除环境等因素外， 遗传可能决定了机体的易感性[1]。2005年Pan等[2]在小鼠巨噬细胞内发现了一个介导巨噬细胞抗胞内病原体的基因， 称为胞内病原体抗性基因1（intracellular pathogen resistance 1， Ipr1）， 该基因与结核病的易感性有着密切的关系。Ipr1基因缺陷的小鼠感染Mtb后巨噬细胞表现为坏死， 从而有利于细菌在宿主体内的繁殖与扩散; 而表达Ipr1基因的小鼠， 巨噬细胞则发生凋亡， 对Mtb的感染表现出天然的抗性。Ipr1基因抗Mtb的具体机制尚不清楚， 因此了解Ipr1基因在巨噬细胞抗Mtb固有免疫和适应性免疫中的作用具有重要意义。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 清洁级C57BL/6J小鼠由重庆医科大学实验动物中心提供。Clontech公司质粒载体pEGFPC1、 大肠杆菌TOP10、 小鼠巨噬细胞株RAW264.7由本室保存。组织/细胞总RNA抽提试剂盒、 RTPCR试剂盒（TaKaRa One Step RNA PCR Kit）、 DNA聚合酶、 限制性内切酶KpnⅠ/BamHⅠ、 DNA连接试剂盒（DNA Ligation Kit Ver.2.0）、 DNA marker、 抗生素等均购自大连宝生物公司。PCR引物合成及测序由上海生工完成。质粒小量抽提试剂盒、 PCR产物纯化试剂盒及胶回收试剂盒均购自上海华舜公司。RPMI1640培养液购自Gibco公司， 胎牛血清为杭州四季青公司产品。转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。激光共聚焦显微镜为德国Leica TCSNT。

　　1.2 方法

　　1.2.1 C57BL/6J小鼠胸腺组织总RNA的提取 摘眼球放血颈椎脱臼处死小鼠， 无菌操作取胸腺组织， 迅速放入液氮， 研磨后按组织/细胞总RNA抽提试剂盒说明提取总RNA， 去离子甲酰胺溶解， 15 g/L琼脂糖凝胶电泳， -70℃保存。

　　1.2.2 RTPCR 根据以发表的Ipr1基因序列（NCBI AY845984）设计2条引物， 在其5′端分别加上KpnⅠ、 BamHⅠ限制性酶切位点， P1: 5′TGCGGTACCATGTTCACTCTGACCAAAGC3′， P2: 5′CGCGGATCCCTAGGCACCCTTCTTTTGA3′。内参阳性对照用一对扩增βactin的222 bp大小片段的引物， P3: 5′GCTGTCCCTGTATGCCTCT3′， P4: 5′TTGATGTCACGCACGATTT3′。按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit试剂盒说明进行RTPCR， 逆转录条件为50℃ 30 min， 94℃ 2 min; PCR条件为98℃变性10 s， 59℃退火30 s， 72℃延伸90 s共30个循环。10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察后胶回收符合目的基因大小的条带。

　　1.2.3 克隆至pEGFPC1载体 PCR胶回收产物与pEGFPC1分别用限制性内切酶KpnⅠ、 BamHⅠ酶切4 h后经PCR产物纯化试剂盒分别纯化PCR产物和载体大片段， 用DNA Ligation Kit Ver.2.0试剂盒中的Solution Ⅰ将载体大片段与PCR产物连接， 反应条件为16℃ 1 h。连接产物转化至CaCl2 法制备的感受态大肠杆菌 TOP10中， 涂布含有30 mg/L卡那霉素的LB平板， 37℃过夜， 次日挑取阳性菌落， 转种至含有 30 mg/L卡那霉素的LB培养液中200 r/min 37℃摇菌过夜， 收集菌体提取质粒后10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察， 阳性质粒进行PCR、 KpnⅠ/BamHⅠ 双酶切鉴定正确后送上海生工测序。

　　1.2.4 细胞转染及表达产物的检测及细胞内定位 小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞用含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液置37℃、 50 mL/L CO2培养箱进行培养， 在细胞状态良好时常规胰酶消化转种至6孔板及预先放入8 mm×8 mm载玻片的24孔板中， 待细胞状态良好及细胞汇片至70%时按转染试剂Lipofectamine2000操作步骤瞬时转染pEGFPIpr1及空载体pEGFPC1[3]。转染开始后1～8 h每隔1 h于倒置荧光显微镜下观察融合蛋白表达情况以及转染后16、 24、 48 h时荧光亮度变化情况。根据倒置荧光显微镜观察结果选取转染后24 h的细胞进行表达的鉴定: 将6孔板细胞抽提总RNA进行RTPCR检测Ipr1基因RNA水平表达; 取出24孔板细胞爬片， 1×PBS洗涤3次， 950 mL/L乙醇固定30 min， 水溶性封片剂封片后立即置激光共聚焦显微镜下观察， 激发波长488 nm， 发射波长525 nm， 采集图像分析融合蛋白的表达及定位。

　　2 结果

　　2.1 C57BL/6J小鼠胸腺组织总RNA的完整性及纯度鉴定 提取C57BL/6J小鼠胸腺组织总RNA， 测定A260/280为1.8左右， 取1 μL进行琼脂糖凝胶电泳显示总RNA的28 S和18 S rRNA带型清晰， 表明总RNA较完整（图1）。

　　2.2 RTPCR扩增结果 RTPCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后， 在约1338 bp处得到特异性目标条带， 与Ipr1基因的编码区大小相符（图2）。

　　图1 C57BL/6J小鼠胸腺组织总RNA琼脂糖凝胶电泳结果（略）

　　Fig 1 Result of C57BL/6J mouse thymus total RNA

　　图2 Ipr1基因的RTPCR结果（略）

　　Fig 2 RTPCR of Ipr1

　　M: DL 2000 DNA marker; 1: RTPCR product of Ipr1 gene; 2: Positive control.

　　2.3 pEGFPIpr1的构建及鉴定 插入正确片段的重组菌落经PCR扩增后， 电泳可见到与目的片段大小一致的PCR产物条带（图3）。

　　图3 PCR鉴定结果（略）

　　Fig 3 PCR identification of Ipr1

　　M: DL 2000 DNA marker; 1: PCR product of Ipr1.

　　抽提质粒KpnⅠ/BamHⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳表明， 酶切后产生一线性空载体条带及一条与理论预测值一致的目的片段（图4）。测序结果与GenBank上公布的Ipr1基因（1338 bp）的cDNA编码序列一致， 获得正确的含Ipr1基因的重组质粒pEGFPIpr1。

　　2.4 pEGFPIpr1转染RAW264.7细胞及表达产物的检测及细胞内定位 瞬时转染RAW264.7细胞24 h后RTPCR结果显示pEGFPIpr1转染组在1338 bp左右和222 bp左右出现条带， 空载体pEGFPC1转染组及未转染质粒组在1338 bp左右未见条带（图5）。

　　图4 pEGFPIpr1重组质粒KpnⅠ/BamHⅠ双酶切结果（略）

　　Fig 4 Enzyme digestion analysis of pEGFPIpr1

　　M: DL 15000 DNA marker; 1: pEGFPIpr1/KpnⅠ/BamHⅠ; 2: pEGFPC1/KpnⅠ/BamHⅠ.

　　图5 pEGFPIpr1转染RAW264.7细胞24 h RTPCR结果（略）

　　Fig 5 RTPCR of Ipr1 transcription production in RAW264.7 cells at 24 h

　　M: DL 2000 DNA marker; 1: RAW264.7 cells transfected with pEGFPIpr1; 2: RAW264.7 cells transfected with pEGFPC1; 3: Nontransfected RAW264.7 cells.

　　转染后倒置荧光显微镜观察结果显示， 在转染4 h开始有微弱荧光表达， 此时荧光表达即位于细胞核内。随后荧光亮度逐渐加强， 在24 h时荧光最强， 48 h荧光强度与24 h荧光强度相似。转染24 h的细胞爬片激光共聚焦显微镜观察结果显示， 转染pEGFPIpr1组绿色荧光表达定位于细胞核内， 空载体pEGFPC1转染组绿色荧光则均匀地表达于整个细胞质和细胞核中（图6）。

　　图6 pEGFPC1Ipr1转染RAW264.7细胞24 h融合蛋白的表达及细胞定位（略）

　　Fig 6 Laser scanning confocal microscopy analysis of Ipr1EGFP fusion protein in pEGFPIpr1 transfected RAW264.7

　　A: RAW264.7 transfected with pEGFPIpr1; B: RAW264.7 transfected with pEGFPC1.

　　3 讨论
　　
　　结核病的病原体——Mtb是一种胞内寄生菌， 感染人体后的结局主要取决于Mtb与机体免疫力之间的相互作用。Mtb感染机体后首先入侵巨噬细胞， 此时巨噬细胞可以通过一系列机制（将Mtb吞噬体递送至溶酶体、 产生反应性氮中间产物、 诱导自身发生凋亡等）对Mtb进行杀伤， 但在机体免疫力不足时Mtb就可以在巨噬细胞内繁殖， 或长期潜伏形成潜伏感染。因此巨噬细胞被认为是抗Mtb感染的第一道防线[4]。有研究显示， 如果抑制巨噬细胞的功能， 即使在机体抗结核病获得性免疫被正常激活的条件下， 机体仍无法完全清除感染的Mtb[5]。因此， 在抗Mtb感染的免疫应答中， 巨噬细胞发挥着极其重要的作用。
　　
　　宿主的遗传因素影响机体对结核病的易感性， 如主要组织相容性复合物（MHC）基因、 维生素D受体（VDR）基因[1]等。2000年， Kramnik等[6]在一种对Mtb特别易感的小鼠品系C3HeB/FeJ（感染Mtb 4～5周死亡， 而普通小鼠要6～8月死亡）的1号染色体上鉴定出一段基因序列sst1（supersusceptibility to tuberculosis 1）与该品系小鼠对Mtb易感性有关。2005年， 该研究小组将C3HeB/FeJ小鼠的sst1区域的序列用C57BL/6J小鼠（对结核病有抵抗性的品系）的相同区域序列置换得到C3HeB/FeJ小鼠的同源导入品系小鼠C3H.B6sst1， 发现该鼠产生了对结核病的抵抗性， 并由该序列克隆得到Ipr1基因， 该基因具有体外调节巨噬细胞对病原体反应能力的作用。然后用转基因方法使易感品系C3HeB/FeJ小鼠获得了对结核病的抵抗性， 证实了Ipr1基因的作用。Ipr1基因表达的上调能有效提高巨噬细胞抗Mtb感染的固有免疫能力，但其具体机制尚不清楚， 而在人类基因组中存在着与小鼠Ipr1基因高度同源的基因SP110b， Ipr1基因与SP110b基因一样含有SP100基序（主要参与介导蛋白质和蛋白质间的相互作用）、 染色质结合域（SAND domain）和核定位信号（NLS）。因此研究者推测Ipr1和SP110可能具有相同的功能， 即通过参与核激素受体、 病原体、 干扰素信号间的信息交流介导机体抗胞内寄生菌的固有免疫[2]。
　　
　　本实验中Ipr1基因的调取选用的实验动物是已经报道表达Ipr1基因的C57BL/6J小鼠。选用小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞是由于该株细胞来源于BALB/c小鼠， 目前国内外还未见报道其有Ipr1基因的表达， 我们的实验结果表明未在该细胞中检测出Ipr1基因mRNA水平的表达， 因此RAW264.7细胞是我们研究Ipr1基因在巨噬细胞抗Mtb等胞内寄生菌机制的理想细胞株。绿色荧光蛋白(GFP)是目前公认的较为优良的一种标记基因， 与目的基因融合后既保持外源蛋白的生物学活性， 又表现出与天然GFP相似的荧光特性[7]， 因此利用GFP可以比较直观的判断转染效率及目的基因的功能定位。本实验我们成功构建了EGFP与Ipr1的融合表达质粒并在小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞中得到成功表达， Ipr1基因编码产物定位于细胞核内， 实验过程中我们未观察到该基因的编码产物在细胞质中的表达， 这一结果符合Pan等[2]对Ipr1基因含有核定位信号（NLS）的分析。本实验证实了Ipr1编码蛋白具有细胞核定位的特性， 从而提示Ipr1编码蛋白可能作为一种调节蛋白参与细胞的转录调控。该结果为下一步研究Ipr1基因的功能， 揭示Ipr1基因在抗结核分枝杆菌感染的机制方面奠定了实验基础。

参考文献

　　[1] Bellamy R. Genetic susceptibility to tuberculosis[J]. Clin Chest Med， 2005， 26(2): 233-246.

　　[2] Pan H， Yan BS， Rojas M， et al. Ipr1 gene mediates innate immunity to Tuberculosis[J]. Nature， 2005， 434(7034): 767-772.

　　[3] 马玲娣， 张 彦， 文世宏， 等. 小鼠TIM2基因真核表达载体的构建及鉴定[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22（6）: 713-715.

　　[4] Pieters J. Entry and survival of pathogenic mycobacteria in macrophage[J]. Microbes Infect， 2001， 3(3): 249-255.

　　[5] Fremond CM， Yeremeev V， Nicolle DM， et al. Fatal Mycobacterium tuberculosis infection despite adaptive immune response in the absence of MyD88[J]. J Clin Invest， 2004， 114(12): 405-412.

　　[6] Kramnik I， Dietrich WF， Demant P， et al. Genetic control of resistance to experimental infection with virulent Mycobacterium tuberculosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2000， 97(15): 8560-8565.

　　[7] Stearns T. Green fluorescent protein. The green revolution[J]. Curr Biol， 1995， 5(3): 262-264.