兔抗人CD1d分子α3结构域抗体的制备与鉴定

　　　　 作者：陈章权， 黄震， 梁晓东， 何天文， 陆田田

【摘要】 　　目的: 制备兔抗人CD1d分子α3结构域（hCD1dα3）多克隆抗体。方法: PCR法扩增出人hCD1dα3编码区基因， 将其克隆入原核表达载体pET28中， 转化大肠杆菌BL21（DE3）， 用IPTG诱导重组蛋白的表达， 用Ni2+NTA Agarose亲和层析法纯化重组蛋白， 以之为免疫原免疫家兔， 制备多克隆抗体， 并用ELISA、 Western blot及免疫组织化学法检测抗体。结果: 成功构建了hCD1dα3原核表达载体pET28/hCD1dα3， 高效表达并纯化hCD1dα3蛋白， 间接ELISA检测所制备抗体的效价为1∶6400， Western blot显示该抗体能与hCD1d特异结合， 免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人小肠组织中的天然hCD1d。结论: 通过制备重组hCD1dα3蛋白为免疫原， 免疫家兔， 成功地制备了效价高、 特异性好的抗hCD1dα3多克隆抗体。

【关键词】 CD1d α3结构域 表达 抗体 制备

　　[Abstract] AIM: To prepare the rabbit antibody against the α3 domain of the human CD1d (hCD1dα3). METHODS: The gene fragment coding for hCD1dα3 was amplified by PCR and cloned into prokaryotic expression vector pET28， then expressed in E.coli BL21(DE3). The recombinant protein hCD1dα3 was purified with Ni2+NTA agarose column and used as immunogen to immunize the rabbit. The titer and specificity of the antihCD1dα3 antibody from the rabbit were analyzed by ELISA， Western blot and immunohistochemistry， respectively. RESULTS: The recombinant hCD1dα3 was successfully expressed and purified， and the polyclonal anithCD1dα3 antibody was successfully prepared. The titer of the antiserum was 1∶6400 by ELISA. Western blot analysis showed this antiboday reacted specifically with hCD1d. Immunohistochemistry analysis showed the antibody could recognize the native hCD1d in the human intestinal tissue. CONCLUSION: The antiCD1dα3 antibody from the rabbit with high titer and specificity has been prepared with purified recombinant hCD1dα3 as immunogen， which lays a foundation for further research into detection and functional study of CD1d.

　　[Keywords]CD1d; α3 domain; expression; antibody; preparation

　　CD1分子独立于MHC分子之外的一类特殊的抗原提呈分子。CD1d是其CD1家簇5个成员中的重要一员， 它提呈的抗原主要为脂质分子， 供NKT细胞识别[1]， 在免疫调节、 NKT细胞的发育及与感染性疾病、 自身免疫性疾病、 肿瘤疾病的发生发展过程中起重要作用[2-4]。CD1d分子由胞外区、 跨膜区和胞内区组成， 其胞外区含3个结构域: 从氨基端开始依次为α1、 α2和α3结构域[5]。Kojo等[6]发现CD1d分子存在α3结构域缺失的变异体， 但尚未见进一步的生物学功能研究报道。我们在研究中也发现， 在一些肿瘤患者体内存在类似的CD1d变异体， 这些突变的CD1d分子存在的生物学意义尚不清楚， 有待研究。抗体是研究免疫分子的重要工具， 目前市场上尚未见有商品化的针对CD1d的α3结构域（CD1dα3）特异性抗体， 也未见有该抗体制备的研究报道。为此， 我们用通过PCR扩增获取了CD1dα3编码区基因， 表达其重组蛋白， 制备其特异性抗体， 同时分析了其应用的可能性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 大肠杆菌DH5α、 大肠杆菌BL21(DE3)为本室保存。雄性新西兰大白兔由广东医学院实验动物中心提供。克隆载体pGEMT、 反转录试剂盒为Promega公司产品。RNA 提取试剂、 表达载体pET28和Ni2+NTA 凝胶为Invitrogen公司产品。Taq酶和限制性内切酶为大连宝生物工程公司产品。PCR产物回收、 质粒纯化试剂盒为QiaGen公司产品。IPTG及DAB购自上海生物工程有限公司。HRP标记的羊抗兔IgG为Dako公司产品。PVDF膜为美国PALL公司产品。常规试剂为国产分析纯。PCR引物合成及DNA序列测定委托上海生物工程公司完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 CD1dα3编码区基因的克隆 （1）人小肠组织总RNA的抽提和反转录反应: 取手术切除的新鲜小肠组织， 抽提RNA。经电泳证实RNA无降解后进行反转录， 操作按反转录试剂盒说明进行。（2）PCR 扩增: 根据GenBank中人CD1d cDNA序列， 设计1对特异引物， 引物1: 5′CCATGGTGAAGCCCAAGGCCTGGCTG3′(划线部分为Nco I酶切位点)， 引物2: 5′CTCGAGCAGGACGCCCTGATAGGAAG3′(划线部分为Xho I酶切位点)， 用以扩增CD1dα3编码区基因。PCR条件设定: 94℃变性30 s， 55℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 32个循环后， 于72℃延伸7 min。PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析并回收纯化。（3）CD1dα3编码区基因的鉴定: 将纯化的PCR 产物与pGEMT载体连接后， 转大肠杆菌DH5α感受态细胞。转化菌液涂布于含氨苄青霉素、 Xgal和IPTG的LB平板上， 于37℃培养过夜， 挑取白色菌落进行培养， 提取重组质粒， 用EcoR I进行酶切鉴定， 阳性克隆进行DNA测序， 测序结果与GenBank中的DNA序列进行同源性比较分析， 将质粒命名为pGEMT/hCD1dα3。

　　1.2.2 原核表达载体的构建 用Nco I和Xho I分别对pGEMT/hCD1dα3质粒和原核表达载体pET28进行双酶切， 凝胶电泳后， 分别切取hCD1dα3基因片段和pET28片段， 回收、 纯化目的片段后， 用连接酶连接过夜， 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞， 然后将菌液涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板， 筛选阳性表达克隆， 进一步用PCR和测序进行鉴定， 命名为pET28/hCD1dα3。

　　1.2.3 hCD1dα3在大肠杆菌中的表达 将pET28/hCD1dα3质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)， 37℃培养过夜， 经PCR筛选及测序鉴定， 阳性克隆于37℃振荡培养过夜， 以1∶50的比例接种到LB液体培养基（含50 mg/L卡那霉素）中， 培养至菌液的A600值到0.5～0.6时加入IPTG(终浓度为1mmol/L)， 37℃诱导表达6 h， 离心收集菌体， 超声破碎后， 分别取细菌裂解上清、 沉淀部分及菌总蛋白进行SDSPAGE分析， 未经诱导的重组菌为对照。

　　1.2.4 重组hCD1dα3的纯化 将工程菌接种于500 mL LB液体培养基中进行诱导表达， 收获细菌沉淀用50 mmol/L TrisCl(pH8.0)洗涤1次， 加入溶菌酶和DNaseI处理后， 置冰浴中超声破菌， 15000 g离心收集沉淀， 洗涤后， 离心获取沉淀， 溶于10 mL裂解缓冲液（8 mol/L尿素， 20 mmol/L磷酸盐缓冲液， pH7.8)中， 上样至Ni2+NTA凝胶柱， 在杂交条件（hybrid condition）下进行纯化， 即在变性条件（denature condition）下上样后， 分别用不同pH的变性洗涤液（denature wash buffer）和天然洗涤液（Native wash buffer）洗涤层析柱， 最后在天然条件（native condition）下洗脱目的蛋白。具体操作步骤按纯化试剂盒说明书进行。主要步骤如下: 上样后， 分别用pH7.8、 pH6.0和pH5.3的变性洗涤液(8 mol/L尿素， 20 mmol/L磷酸盐缓冲液)及天然洗涤液（20 mmol/L磷酸盐缓冲液， pH8.0）充分洗涤， 最后用含200 mmol/L咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱回收。

　　1.2.5 抗体的制备及鉴定 将浓缩后的重组蛋白浓度调整为1 g/L， 与等量的佐剂研磨， 用于免疫家兔， 具体的制备方法参照文献[7]进行。免疫完毕， 经颈总动脉放血、 分离血清。用间接ELISA法检测抗体效价， 用Western blot对抗体特异性和活性进行鉴定， 方法参照文献[7]进行。用人小肠组织作免疫组织化学检测， 对抗体的活性和特异性作进一步的分析， 多抗按1∶300稀释， 采用DAB显色。同时以正常家兔血清作对照。

　　2 结果

　　2.1 hCD1dα3编码区基因的扩增 1 g/L琼脂糖凝胶电分析PCR扩增产物显示， 在250 bp上边附近有一条特异条带(图1)， 与预期的目的片段大小相符， 经测序鉴定， 得到hCD1dα3编码区基因片段为279 bp， 碱基序无突变， 阅读框正确， 阳性克隆命名为pGEMT/hCD1dα3。

　　图1 琼脂糖凝胶电泳分析RTPCR扩增产物（略）

　　Fig 1 Analysis of the PCR product of hCD1dα3 by agarose gel electrophoresis

　　M: DNA marker; 1: PCR product of hCD1dα3.

　　2.2 表达载体的构建与鉴定 表达载体质粒pET28和克隆质粒pGEMT/hCD1dα3经Nco I和Xho I双酶切后， 分别回收目的片段， 用连接酶连接后， 构建表达载体pET28/hCD1dα3。经PCR和DNA序列测定， 证实目的片段大小为279 bp的hCD1dα3编码区基因片段正确插入pET28， 碱基序无突变， 3′端含6×His序列， 阅读框正确， 可用于下一步的诱导表达。

　　2.3 重组蛋白的诱导表达、 纯化与鉴定 将pET28/hCD1dα3质粒转化大肠杆菌BL21DE3， 得到含重组质粒的基因工程菌。SDSPAGE分析表明， 未经IPTG诱导的该工程菌不表达外源蛋白， 而经IPTG诱导的工程菌在Mr约15000处有一条高表达的外源蛋白条带， 与预测的目的蛋白的Mr相吻合， 重组蛋白的表达主要以包涵体的形式存在（图2）。在杂交条件下纯化重组蛋白， 从500 mL细菌培养液中纯化得到约3 mg蛋白， 经凝胶扫描分析显示， 所得的蛋白纯度为93%， 纯度较高（图2）。

　　2.4 抗血清的效价及特异性的鉴定 利用纯化的重组hCD1dα3为抗原， 通过常规免疫家兔，　　获得兔抗hCD1dα3抗体， ELISA检测效价其为1∶6400， 可用于对抗原进行检测。以制备的兔抗人CD1dα3血清作一抗， 进行Western blot检测， 结果显示， 诱导表达菌蛋白及纯化蛋白出现了特异反应条带， 而在未加诱导剂的菌体蛋白中未见有反应条带， 表明所制备的抗体与人CD1d特异结合。应用所制备的抗体检测人肠组织石蜡切片， 免疫组织化学染色结果显示， 制备的抗体作为一抗有明显的阳性着色， 抗原分布主要呈胞膜型， 而应用正常家兔血清为一抗则无阳性着色（图3）， 说明所制备的兔抗hCD1dα3抗体可特异识别天然状态下的CD1d分子， 抗体具有良好的活性和高特异性。

　　图2 hCD1dα3重组蛋白的SDSPAGE和抗体特异性的Western blot鉴定分析（略）

　　Fig 2 Aanalysis of the hCd1dα3 recombinant protein by SDSPAGE and the the specificity of the antihCD1dα3 by Western blot

　　A: 1: Purified hCD1dα3 recombinant protein; 2: Supernatant of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1dα3 with IPTG induction; 3: Deposit of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1dα3 with IPTG induction; 4: Lysate of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1dα3 with IPTG induction; 5: Lysate of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1dα3 without induction; M: Protein marker. B: 1: Lysate of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1dα3 without induction; 2: Lysate of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1dα3 with IPTG induction; 3: Purified hCD1dα3 recombinant protein.

　　图3 兔抗hCD1d抗血清特异性的免疫组织化学分析（略）

　　Fig 3 Analysis of specificity of antiserum against hCD1d by Immunohistochemistry (×100)

　　A: Rabbit antiserum against hCD1dα3; B: Negative control(normal rabbit serum).

　　3 讨论
　　
　　CD1d主要表达于抗原提呈细胞和小肠上皮细胞等细胞[8， 9]， 尤其是小肠上皮细胞基底膜侧的细胞表面有大量的CD1d[9]。人CD1d分子胞外区含3个结构域， 即α1、 α2和α3结构域， α3结构域含有93个氨基酸残基。在实验中， 采用手术切除的小肠组织提取总RNA， 由于所用的组织选择合理， 用RTPCR技术成功地扩增出279 bp的CD1dα3编码区基因片段， 序列与GenBank上登录序列(登录号: NM 001766)完全一致。为便于纯化， 本实验选用了含6×His的pET28载体。在重组蛋白的制备过程中， 发现重组CD1dα3蛋白主要以包涵体的形式存在， 通过NiNTA凝胶亲和层析， 在杂交条件下纯化目的蛋白， 即在变性条件下上样， 经过不同pH的变性缓冲液和天然缓冲液的洗涤后， 在天然条件下， 用咪唑进行洗脱回收， 效果良好。由于洗脱回收产物不存在变性剂， 免去了样品复性的麻烦。将纯化的重组蛋白免疫家兔， 效价为1∶6400， 免疫组化检测显示， 所制备的多克隆抗体能识别天然的CD1d分子， 表明其活性良好， 能用于下一步的相关研究工作。
　　
　　CD1d分子是由有CD1d重链和β2微球蛋白（β2m）组成的一个异二聚体分子，其结合部位是α3结构域[5]。正常情况下， 新生的CD1d在内质网与β2m结合后， CD1d进行折叠和二硫键的形成， 形成成熟的CD1d分子[10]。Kojo等报道了α3结构域缺失的CD1d分子变异体的存在[5]， 我们也在发现在某些肿瘤患者体体内存在类似的CD1d分子变异体。由于CD1d分子的抗原结合槽是由α1和α2结构域构成的， α3结构域缺失的CD1d分子变异体的抗原提结合位点依然完好， 其存在有何生物学意义？ 至今尚不清楚。本实验针对CD1d的α3结构域， 成功制备其特异性抗体， 为进一步开展CD1d及α3结构域缺失的CD1d分子变异体生物学功能研究奠定了实验基础。

参考文献

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