肿瘤坏死因子β基因多态性与西方型、 亚洲型多发性硬化的相关性

　　　　 作者：宋秀娟， 郭力， 侯慧清， 杨静， 刘静

【摘要】 　　目的: 研究肿瘤坏死因子β（TNFβ）基因多态性与西方型、 亚洲型多发性硬化（MS）的相关性。方法: 采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术对22例西方型MS患者、 36例亚洲型MS患者和79名健康人进行TNFβ基因多态性分析。对两型MS组患者分别进行神经功能缺损程度的扩展病残状态(EDSS)评分、 首发年龄、 病程、 发病次数等临床资料收集。结果: ①亚洲型MS组TNFβ1等位基因频率为51.39%， 较健康人（27.85%）明显升高（P&<0.01)。②西方型MS组与亚洲型MS组基因型为TNFβ1/1、 TNFβ1/2、 TNFβ2/2 的EDSS评分组间比较差异均无统计学意义（P&>0.05)。③两亚型在EDSS评分、 首发年龄、 性别、 病程、 发病次数诸方面均无统计学意义。结论: TNFβ1等位基因与亚洲型MS的易患性有关。TNFβ基因多态性与EDSS评分无明显相关性。

【关键词】 肿瘤坏死因子β 多发性硬化 多态性 等位基因 EDSS

　　多发性硬化（multiple sclerosis， MS）是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘为主要特征的自身免疫性疾病。肿瘤坏死因子β（tumor necrosis factor beta， TNFβ）是一种参与免疫应答的细胞因子， 研究发现TNFβ具有基因多态性[1]。由于TNFβ的重要免疫学作用， 有必要从分子水平进一步探讨西方型和亚洲型MS的免疫遗传机制。我们采用聚合酶链式反应限制性片段长度多态性（PCRRFLP）技术， 探讨了TNFβ基因多态性在两型MS患者中的分布， 并将基因多态性与两型MS的扩展病残状态（an expanded disability status scale， EDSS）评分以及两型MS临床资料之间的差异进行了相关性研究。

　　1 对象和方法

　　1.1 研究对象 MS患者58例系2003～2006年我院住院患者， 均符合临床确诊及实验室检查支持确诊的MS诊断标准， 依据Kira等[2]的方法将MS分为西方型和亚洲型两型。西方型组22（男9， 女13）例， 年龄15～71岁， 平均32.1岁; 首次发病年龄11～63岁， 平均30.2岁; 病程6 d～108个月， 平均26.1个月; 发病次数1～8次， 平均2.4次。亚洲型组36（男12， 女24）例， 年龄17～63岁， 平均38.8岁; 首次发病年龄17～63岁， 平均36.7岁; 病程18 d～180个月， 平均32.6月; 发病次数1～6次， 平均2.3次。并对MS组患者分别进行神经功能缺损程度的EDSS评分[3]。正常对照组79（男27， 女52）例， 年龄14～69岁， 平均35.9岁。为本地健康献血员、 患者邻居或其家庭中与患者无血缘关系者。近期均无感染史， 经问诊和体检排除神经系统疾病和其他自身免疫性疾病， 年龄和性别均与病例组患者匹配。全部受试对象均取得知情同意。

　　1.2 方法

　　1.2.1 TNFβ基因多态性分析 以改良盐析法自抗凝血标本中抽提基因组DNA。采用PCR方法扩增TNFβ基因内含子区域包括+252位点的一段靶DNA， PCR体系总体积为50 μL， 上游引物为5′CCG TGC TTC GTG CTT TGG ACT A3′， 下游引物为5′AGA GCT GCT GGG GAC ATG TCT G3′(引物序列为北京赛百盛公司合成)， 参照Tarkowski等[4]的实验方法设计PCR扩增条件。扩增产物片段长度为782 bp。RFLP分析: 取10 μL PCR产物， 加入1单位Noc Ⅰ， 10×酶切缓冲液2 μL， 灭菌双蒸水补至总体积20 μL， 37℃温箱过夜。酶切产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳， 凝胶分析仪观察带型。实验中设阳性和阴性对照， 以确保PCR产物未被污染和限制性内切酶工作正常。基因分型实验在双盲状态下进行并对样本进行重复分型以控制随机分型错误。

　　1.2.2 EDSS评分 先根据锥体系统功能、 小脑功能、 脑干功能、 感觉功能、 直肠膀胱功能、 视觉功能、 大脑功能及其他功能共8项指标分别量化评分， 再综合得出神经功能缺损程度的EDSS总分。

　　1.2.3 统计学处理 TNFβ基因型、 等位基因、 性别用直接计数法， 并计算基因型及等位基因频率， 组间比较采用χ2检验。EDSS评分、 年龄、 病程及发病次数以x±s表示， 两组间比较用t检验， P&<0.05为有统计学意义。所有分析均由SAS 6.12统计软件包完成。

　　2 结果

　　2.1 TNFβ基因多态性的判断 TNFβ等位基因片段经PCR扩增、 NocⅠ酶切、 琼脂糖凝胶水平电泳， 产生3种不同的电泳条带（即不同的基因型）。TNFβ1/1（+252G）纯合子有NocⅠ酶切位点， 可被完全酶切为196、 586 bp2条带; TNFβ1/2 (+252G/A)杂合子产生不完全酶切， 出现782、 586、 196bp3条带; TNFβ2/2（+252A）纯合子不产生酶切， 只出现782 bp1条带（图1）。采用单纯随机抽样对其中部分样本进行重复基因型检测， 结果一致。

　　图1 经限制性内切酶Noc Ⅰ酶切后的TNFβ的3种基因型（略）

　　1: DNA marker; 2， 4， 6: TNFβ1/2 (+252G/A)杂合子基因型; 3， 5: TNFβ1/1（+252G）纯合子等位基因; 7， 8: TNFβ2/2（+252A）纯合子等位基因.

　　2.2 TNFβ基因多态性与两型MS的关系 西方型MS组各TNFβ基因型及等位基因频率与健康对照组比较， 差异均无统计学意义。亚洲型MS组和健康对照组TNFβ基因型及等位基因的分布和频率见表1， 两组之间基因型分布的比较， 差异有统计学意义（P&<0.01）; 亚洲型MS组TNFβ1等位基因频率（51.39%）明显高于对照组（27.85%， P&<0.01）。

　　表1 亚洲型MS组TNFβ基因型和等位基因频率比较（略）

　　bP&<0.01 vs 对照组.

　　2.3 TNFβ基因多态性与EDSS评分的关系 西方型MS组基因型为TNFβ1/1、 TNFβ1/2、 TNFβ2/2 的EDSS评分分别为（4.0±1.9）、 (3.7±1.6)、 （4.4±1.8）， 组间比较差异无统计学意义。亚洲型MS组基因型为TNFβ1/1、 TNFβ1/2、 TNFβ2/2 的EDSS评分分别为（3.9±2.5）、 (4.7±2.4)、 （4.6±2.2）， 组间比较差异无统计学意义。

　　2.4 两型MS的EDSS评分等临床资料之间的比较 两型MS组的EDSS评分、 首次发病年龄、 病程及发病次数依次分别为（4.1±1.7）、 （4.4±2.3）; （30.2±14.3）、 （36.7±14.1）; （26.1±30.8）、 （32.6±57.7）; （2.4±1.6）、 （2.3±1.3）， 两组比较差异均无统计学意义。性别构成两组比较差异无统计学意义。

　　3 讨论
　　
　　中国、 日本等亚洲人的MS与西方人MS的病理变化有所不同， 以视神经和脊髓受累较常见。流行病学调查[5]发现MS发病具有遗传倾向， 而且是多基因遗传。主要易感基因包括人类白细胞抗原（HLA）基因、 T细胞受体（TCR）基因和其他基因[6]。其中TCR识别HLA、 CD4+T细胞识别自身抗原产生的级联炎症是关键的步骤之一， TNFα而参与这些炎症反应的炎症因子包括TNF（包括TNFβ和TNFβ）、 白细胞介素（IL）1[7]、 IL6等。TNFβ主要由淋巴细胞产生， 具有复杂的生物学活性， 参与炎症反应、 免疫系统的发育、 免疫调节等。
　　
　　TNFβ基因位于人类6号染色体短臂上（6P21区）， HLAⅢ类基因区内。在TNFβ基因的第一内含子、 转录起始位点下游第252位点（+252位点）存在多态性。该位点由腺嘌呤核苷酸A替代了鸟嘌呤核苷酸G， G存在的基因称为TNFβ1， A替代的基因称为TNFβ2。这一位点的突变使限制性内切酶NocⅠ的识别系列发生变化，致使被腺嘌呤核苷酸A所替代的序列不能被NocⅠ识别和切断。我们的系列研究提示TNFβ基因多态性与MS的遗传易患性相关。由于在MS中有不同临床亚型存在，有可能影响对结果的分析， 所以将西方型MS组和亚洲型MS组分别与对照组比较进行统计学处理， 结果提示TNFβ基因多态性仅与亚洲型MS的遗传易患性相关。马建军等[8]研究发现， MOG51/52的222 bp等位基因与西方型MS相关， 而与亚洲型MS无关。HLADRB1*1501与西方型MS相关， 而与亚洲型MS无关[2]。HLADPB1*0501与亚洲型MS相关， 却与西方型MS无关， 提示不同类型的MS可能是由不同的关联基因决定的。
　　
　　为进一步探讨TNFβ基因多态性在MS发病中的作用以及在北方汉族的两型MS发病之间有无差别， 我们研究了TNFβ基因多态性与临床EDSS评分之间的关系以及两亚型临床资料之间的差异， 结果表明TNFβ基因多态性与临床EDSS评分之间无紧密联系。并且两型MS在EDSS评分、 性别、 首次发病年龄、 病程以及发病次数诸方面均无统计学意义。

参考文献

　　[1] Mcsser G， Spengler U， Jung MC， et al. Polymorphic structure of the tumor necrosis factor(TNF) locus: an NcoⅠ Polymorphism in the first intron of the human TNFβ gene correlates with a variant amino acid in position 26 and a reduced level of TNFβ production[J]. J Exp Med， 1991， 173(1): 209-219.

　　[2] Kira J， Kanai T， Nishimura Y， et al. Western versus Asian types of multiple sclerosis: immunogenetically and clinically distinct disorders[J]. Ann Neurol， 1996， 40(4): 569-574.

　　[3] Kurtzke JF. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale（EDSS）[J]. Neurology， 1983， 33(11): 1444-1452.

　　[4] Tarkowski E， Liljeroth AM， Nilsson A， et al. TNF gene polymorphism and its relation to intracerebral production of TNFα and TNFβ in AD[J]. Neurology， 2000， 54(11): 2077-2081.

　　[5] 周文斌， 崔玉真， 肖 波. 多发性硬化的流行病学研究[J]. 中国神经免疫学和神经病学杂志， 2005， 6（12）: 373-375.

　　[6] Kenealy SJ， PericakVance MA， Haines JL. The genetic epidemiology of multiple sclerosis[J]. J Neuroimmunol， 2003， 143(1-2): 7-12.

　　[7] 周 刚， 刘利民， 孙学科， 等. 白细胞介素1基因多态性与疾病[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2007， 23(2): 190-192.

　　[8] 马建军， 徐予明， 徐 军， 等. 亚洲型和西方型多发性硬化髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白微卫星等位基因多态性的比较[J]. 郑州大学学报（医学版）， 2003， 38(4): 506-508.