mOX40Ig的表达及其生物学活性的初步研究

　　 作者：刘艳菲， 林志娟， 冯永堂， 许传武， 史琳， 苗乃法

【摘要】 　　目的: 构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体， 转染CHO细胞进行稳定表达， 获得有生物学活性的mOX40Ig融合蛋白。方法: RTPCR法扩增获得hIgG1Fc段基因， 构建pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒并经测序证实。从本室保存的pIRES2EGFPmOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段， 将其插入pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体。脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达， 用RTPCR与ELISA法检测其表达， 蛋白A亲和纯化后， SDSPAGE进行鉴定。3HTdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用。结果: 测序证实hIgG1Fc段、 mOX40胞外段及mOX40Ig基因序列正确， RTPCR与ELISA证实mOX40Ig的表达， SDSPAGE证实其为mOX40Ig融合蛋白， 3HTdR掺入法显示mOX40Ig在体外能有效地促进B细胞增殖。结论: 成功地构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体， 并获得有生物学活性的mOX40Ig融合蛋白的稳定表达， 为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础。

【关键词】 OX40 mOX40 Ig CHO细胞 真核表达

　　[Abstract] AIM: To construct a recombinant eukaryotic expression vector containing pcDNA3.1mOX40Ig fusion gene and obtain mOX40Ig fusion protein with bioactivity by transfecting CHO cells. METHODS: The gene fragment encoding the human IgG1Fc was amplified by RTPCR and the eukaryotic expression vector pcDNA3.1hIgG1Fc was constructed. After sequencing， mOX40 extracellular gene was cloned from pIRES2EGFPOX40 by PCR and then inserted into the recombinant vector pcDNA3.1hIgG1Fc. The right recombinant was transfected into CHO cells with lipofectin Ragent and its expression was detected by RTPCR and sandwichELISA. After purified by protein A affinity column chromatography， the mOX40Ig fusion protein was identified by SDSPAGE and its effect on the proliferation of B cells in vitro was studied by 3HTdR method. RESULTS: The hIgG1Fc， mOX40 extracellular gene and mOX40Ig gene were consistent with DNA sequencing.The expression of mOX40Ig fusion protein in CHO cells was confirmed by RTPCR， sandwichELISA and SDSPAGE. 3HTdR analysis showed the mOX40Ig fusion protein stimulated the proliferation of B cells in vitro. CONCLUSION: A eukaryotic expression vector containing pcDNA3.1mOX40Ig has been constructed successfully and the stable expression of mOX40Ig fusion protein with bioactivity has been acquired， which lays a solid basis for further study of the application related to OX40.

　　[Keywords]OX40; mOX40Ig; CHO cell line; eukaryotic expression

　　OX40/OX40L作为免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子， 对延长T细胞的寿命、 促进其增殖[1， 2]、 刺激DC细胞的分化成熟[3]、 促进生发中心的形成均有重要的作用[4]。本研究我们通过构建pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体， 将其转染CHO细胞， 获得可溶性mOX40Ig融合蛋白的稳定表达， 并进行初步的鉴定和生物学活性检测， 为进一步研究OX40分子在肿瘤免疫、 自身免疫性疾病中的作用奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 TRIzol购自Gibco公司; MMLV第1链cDNA合成试剂盒、 Taq DNA聚合酶、 各种限制性内切酶及T4连接酶均购自MBI公司; Agarose（西班牙分装）购自上海生工公司; Lipofectin Reagent购自Invitrogen公司。胎牛血清购自杭州四季青公司。G418购自北京华美公司。蛋白A亲和层析柱购自本元正阳公司。羊抗人IgG、 正常人IgG、 HRP标记鼠抗人IgGFc购自宁波新芝生物公司。小鼠mIgM激发型抗体及抗CD40激发型单克隆抗体(mAb)购自R&&D公司。 3HTdR购于中国原子能科学研究院。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank中登录的人IgG1Fc段及小鼠OX40胞外段 cDNA序列， 利用引物设计软件Primer Premier5.0进行引物设计， 全部引物由上海生工合成。hIgG1Fc段上、 下游引物P1、 P2为: 5′CGGAATTCACTTGCCCACCGTGCCCAG3′， 含EcoR I的酶切位点， 5′CCGCTCGAGTCATTTACCCGGAGACAGGGAG3′， 含Xho I的酶切位点。小鼠OX40胞外段上、 下游引物P3、 P4为: 5′CGGGATCCAAGATGTATGTGTGGGTTCAG3′， 含BamH I的酶切位点， 5′CGGAATTCAGGTCCCTCAGGAGTCAC3′， 含EcoR I的酶切位点。

　　1.2.2 RTPCR法扩增hIgG1Fc段基因 Ficoll密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞后， 按TRIzol试剂盒说明书抽提总RNA。RTPCR反应体系为20 μL: 在冰浴的Eppendorf管中依次加入总RNA 5 μL， 随机引物1 μL和无RNA酶去离子水6 μL， 轻轻混匀后70℃水浴5 min 置冰上， 再加入5×Reaction Buffer 4 μL， RNaseInhibitor(200万U/L) 1 μL及dNTP Mix(10 mmol/L) 2 μL， 轻轻混匀后37℃水浴5 min， 再加入1 μL RevertAidTMMMuLV逆转录酶(200万U/L)， 反应混合物在25℃温育10 min后， 37℃水浴60 min， 再70℃加热10 min结束反应后， 冷冻保存于-20℃备用。以上述逆转录cDNA为模板， P1、 P2为上下游引物扩增hIgG1Fc段基因， 反应条件为: 95℃预变性5 min后， 以94℃变性1 min， 56℃退火1 min， 72℃延伸1 min， 为1个循环， 共32个循环， 最后再于72℃延伸10 min。

　　1.2.3 重组pcDNA3.1hIgG1Fc的构建 hIgG1Fc段PCR产物纯化后与pcDNA3.1载体分别经EcoR I和Xho I双酶切37℃， 4 h， 65℃水浴灭活20 min， 割胶回收酶切后的目的片段， 连接转化感受态细菌; 筛选阳性克隆经质粒PCR、 限制性酶谱分析及测序分析确证。

　　1.2.4 PCR法扩增小鼠OX40胞外段 以本室构建鉴定并保存的pIRES2EGFPOX40重组质粒为模板， 以P3、 P4为上下游引物扩增小鼠OX40胞外段基因， 反应条件为: 95℃预变性5 min后， 94℃变性55 s， 55℃退火1 min， 72℃延伸1 min， 为1个循环， 共30个循环， 最后再于72℃延伸10 min。

　　1.2.5 真核表达载体pcDNA3.1mOX40Ig的构建 小鼠OX40胞外段PCR产物纯化后与测序正确的pcDNA3.1hIgG1Fc重组质粒分别用BamH I和EcoR I进行双酶切， 37℃， 4 h后置65℃灭活20 min， 16℃连接过夜， 转化感受态DH5α菌株， 筛选阳性克隆即重组真核表达载体pcDNA3.1mOX40Ig; 重组质粒分别经质粒PCR、 限制性酶谱分析及测序分析证实。

　　1.2.6 表达mOX40Ig的CHO细胞株的构建及稳定转染 将pcDNA3.1mOX40Ig重组质粒以脂质体法转染96孔板中已70%～80%融合的CHO细胞。转染48 h后， 置于含G418的选择培养液中， 筛选培养2周后再用有限稀释法挑取阳性克隆。

　　1.2.7 RTPCR检测外源OX40Ig mRNA的表达 收集G418抗性细胞， TRIzol法抽提总RNA， 逆转录获得cDNA后分别以P3+P4、 P3+P2、 P1+P2为上下游引物进行PCR扩增， 琼脂糖电泳测定扩增产物。

　　1.2.8 夹心ELISA法检测上清中mOX40Ig融合蛋白的表达 用10 mg/L的羊抗人IgG包被酶标板， 酶标抗体为HRP标记鼠抗人IgGFc mAb， 同时以正常人IgG为阳性对照， 以转染有pcDNA3.1空载体的细胞培养上清为阴性对照。

　　1.2.9 蛋白A亲和层析柱纯化及纯化蛋白的鉴定 样品的纯化按说明书进行。SDSPAGE完毕后以考马斯亮蓝G250染液染色， 鉴定纯化后mOX40Ig融合蛋白的分子量。

　　1.2.10 小鼠B淋巴细胞的制备 小鼠眼球放血处死， 无菌取脾脏， 移入滤网中研磨， 用Ficoll分离单个核细胞。PBS洗后， 贴壁2 h去除贴壁细胞， 吸出富集的B细胞备用。

　　1.2.11 淋巴细胞增殖试验 将反应B细胞按1×105个/孔的浓度加到预先用抗小鼠mIgM激发型抗体（1 mg/L）包被的96孔板中， 同时加入或不加入抗小鼠CD40激发型抗体（1 g/L）。培养2 d后， 分别加入1∶10、 1∶20、 1∶40倍比稀释的纯化 mOX40Ig， 同时设阴性对照（不同浓度的人IgG）， 空白对照（含100 mL/L FCS 的RPMI1640培养液）， 每组设5个复孔。在37℃、 50 mL/L CO2培养箱中共培养2 d， 加入3HTdR(0.5μci/孔)， 于37℃共育16h。将细胞收集于24nm玻璃纤维纸片上， 使用β液体闪烁计数器测定每个样品的cpm值。

　　1.2.12 统计学处理 采用SAS8.0软件对数据进行单因素方差分析和多元方差分析。

　　2 结果

　　2.1 hIgG1Fc段基因的扩增及重组载体pcDNA3.1hIgG1Fc的构建 RTPCR法从正常人外周血单个核细胞中扩增出约650 bp的hIgG1Fc段基因（图1）， 重组载体经PCR、 限制性酶谱分析后（图2）进行DNA测序。结果显示， 所获得的hIgG1Fc段基因序列与GenBank中报道的序列完全一致。

　　图1 RTPCR法扩增人IgG1Fc段基因电泳检测（略）

　　Fig 1 The agarose electrophoresis of RTPCR product of human IgG1Fc gene

　　1: DNA marker; 2: cDNA fragment encoding the human IgG1Fc; 3: βactin.

　　图2 重组载体pcDNA3.1hIgG1Fc的酶切鉴定（略）

　　Fig 2 Results of recombinant pcDNA3.1hIgG1Fc Digested by EcoR I plus Xho I

　　1: DNA marker; 2: pcDNA3.1hIgG1Fc/EcoR I+Xho I; 3: pcDNA3.1; 4: pcDNA3.1hIgG1Fc.

　　2.2 小鼠OX40胞外段的扩增及真核表达载体pcDNA3.1mOX40Ig的构建 PCR法扩增获得的小鼠OX40胞外段基因约690 bp左右（图3）， 重组真核表达载体pcDNA3.1mOX40Ig经质粒PCR（图4）、 限制性酶谱分析（图5）后进行DNA测序。结果显示， 所获得的小鼠OX40胞外段及hIgG1Fc段基因序列均与GenBank中报道的序列完全一致， 并且拼接后的小鼠OX40胞外段及hIgG1Fc段基因未发生移码突变。

　　图3 PCR扩增小鼠OX40胞外段基因电泳检测（略）

　　Fig 3 Amplification of mouse OX40 extracellular gene by PCR

　　1: DNA marker; 2: Mouse OX40 extracellular gene.

　　图4 重组载体pcDNA3.1mOX40Ig的PCR鉴定结果（略）

　　Fig 4 PCR analysis of recombinant pcDNA3.1mOX40Ig

　　1: The human IgG1Fc gene; 2: DNA marker; 3: Mouse OX40 extracellular gene; 4: mOX40＋hIgG1Fc.

　　图5 重组载体pcDNA3.1mOX40Ig的酶切鉴定（略）

　　Fig 5 Restrictive enzyme digestion analysis of recombinant pcDNA3.1mOX40Ig

　　1: λDNA/EcoR I+Hind III marker; 2: pcDNA3.1mOX40Ig; 3: pcDNA3.1mOX40Ig/EcoR I+Xho I; 4: pcDNA3.1mOX40Ig/BamH I+Xho I; 5: pcDNA3.1mOX40Ig/Hind III+Xho I; 6: DNA marker.

　　2.3 mOX40Ig的表达、 纯化及鉴定

　　2.3.1 RTPCR检测 将鉴定正确的pcDNA3.1mOX40Ig以脂质体法转染CHO细胞， 经G418筛选获得稳定表达mOX40Ig的细胞株。RTPCR鉴定表明， 从CHO/mOX40Ig细胞中能扩增出小鼠OX40胞外段（约650 bp）、 hIgG1Fc（约690 bp）及mOX40Ig（约1330 bp）特异性条带; 而转染pcDNA3.1的细胞样品未扩增出特异性条带（图6）。

　　图6 稳定表达mOX40Ig的CHO的RTPCR鉴定（略）

　　Fig 6 Identification of mOX40Ig stably expressed CHO by RTPCR

　　1: DNA marker; 2-4: The CHO cells transfected with pcDNA3.1mOX40Ig; 5: The CHO cells transfected with pcDNA3.1.

　　2.3.2 转染细胞上清的双抗体夹心ELISA法检测结果 为了检测上清中是否有mOX40Ig融合蛋白的表达， 我们建立了一种针对mOX40Ig融合蛋白中Fc段的夹心ELISA检测法。阴性对照为转染有pcDNA3.1空载体的细胞培养上清， 阳性对照为纯化的人IgG。结果显示: 阳性转染细胞上清与阳性对照的A490值接近， 其与阴性对照组及空白调零组（PBST）的差异均有统计学意义（P&<0.01）。我们认为据此可初步判定上清中有目的蛋白—可溶性mOX40Ig融合蛋白的表达。取1次收集的上清原液作一系列倍比稀释后夹心ELISA检测结果如图7所示。

　　图7 夹心ELISA检测mOX40hIgG1Fc的表达（略）

　　Fig 7 Confirmation of the fusion protein mOX40Ig expression by sandwich ELISA assay

　　2.3.3 mOX40Ig融合蛋白表达的SDSPAGE鉴定 收获pcDNA3.1mOX40Ig转染CHO细胞培养上清， 经蛋白A纯化后， 取20 μL在还原条件下进行SDSPAGE分析， 结果显示: 在还原条件下， 转染有pcDNA3.1mOX40Ig的细胞上清纯化后可见有一Mr位于66.2 ×103～43×103之间的特异性蛋白带（图8）， mOX40Ig融合基因编码434个氨基酸， 切除可能的含19个氨基酸的信号肽后， 还剩415个氨基酸， Mr 46.3×103（单体且未糖基化时）。考虑到真核表达过程中糖基化对分子量的影响， 可认为与估计的Mr 46.3×103基本相符。

　　2.4 mOX40Ig融合蛋白对B细胞的体外促增殖作用 mOX40Ig融合蛋白能有效促进B细胞增殖， 说明我们获得了有生物学活性的mOX40Ig融合蛋白， 并且随着其浓度的增高， 促增殖效应越明显， 但其作用强度不如抗CD40 mAb明显（P&<0.05）， 两者联合应用的促增殖效应较单独应用mOX40Ig融合蛋白或抗CD40 mAb均具有统计学意义（P&<0.05， 图9）。

　　图8 mOX40Ig融合蛋白的SDSPAGE鉴定（略）

　　Fig 8 Identification of relative molecular weight of the fusion protein mOX40Ig

　　图9 mOX40Ig对小鼠B细胞的体外促增殖作用（略）

　　Fig 9 The influence on B cell proliferation stimulated with mOX40Ig in vitro

　　3 讨论
　　
　　OX40/OX40L是免疫应答过程中一对重要的协同刺激分子， 它们的相互作用能促进CD4+T细胞的活化、 增殖、 迁移， 延长其寿命， 并促进生发中心的形成和DC的分化成熟。OX40（CD134）， 是TNFR超家族成员之一， 为I型跨膜糖蛋白， 属活化后诱导表达， 即只表达于活化的T细胞表面， 且主要是CD4+T细胞， CD8+T细胞表面有少量表达[5]。表达OX40的T细胞只在炎症处存在， 其阳性T细胞是抗原特异性T细胞， 在外周血中不存在， 其表达时相较晚且短暂， 这些特点成为其治疗由T细胞介导的多种自身免疫性疾病及防治移植排斥的有利条件。除此之外， 在对免疫耐受影响的研究中发现， 许多共刺激分子都可以阻止耐受的形成， 而耐受一旦形成， 只有OX40可以打破已建立的外周耐受[6]， 从而可以打破肿瘤的免疫耐受， 恢复免疫监视。以往研究显示， OX40/OX40L在机体的免疫应答和多种疾病中均起重要作用， 而通过对OX40及其配体相互作用的干预可能是治疗多种人类疾病的有效途径之一[7]。
　　
　　有研究显示， OX40胞外段与各种IgG的Fc段融合构建的融合蛋白中， 与IgG1的Fc段融合所构建的融合蛋白与OX40L结合的亲和力最强[8]。本研究中， 我们将OX40胞外段与IgG1Fc段融合构建了pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体， 转染CHO细胞后， 经RTPCR、 双抗体夹心ELISA及SDSPAGE分析证实我们获得了mOX40Ig融合蛋白的分泌性表达。同时， 我们对mOX40Ig融合蛋白的功能进行了初步的体外研究。 3HTdR掺入试验表明， 分泌表达的mOX40Ig融合蛋白能够明显促进B细胞增殖， 若将其与抗CD40 mAb共同作用于B细胞， 其促增殖作用更为明显。本研究中我们成功地构建了pcDNA3.1mOX40Ig真核表达载体， 将其转染CHO细胞， 获得了可溶性mOX40Ig融合蛋白的稳定表达， 并进行了初步的鉴定和生物学活性检测， 为进一步研究OX40分子在移植耐受的诱导及自身免疫病治疗中的作用打下良好的基础。

参考文献

　　[1] Huddleston CA， Weinberg AD， Parker DC. OX40 (CD134) engagement drives differentiation of CD4+T cells to effector cells[J]. Eur J Immunol， 2006， 36(5): 1093-1103.

　　[2] Mendel I， Shevach EM. Activated T cells express the OX40 ligand: requirements for induction and costimulatory function[J]. Immunology， 2006， 117(2): 196-204.

　　[3] Wang YH， Ito T， Wang YH， et al. Maintenance and polarization of human Th3 central memory T cells by thymic stromal lymphopoietinactivated dendritic cells[J]. Immunity， 2006， 24(6): 827- 838.

　　[4] 原江水， 冯永堂， 王 菲， 等. 小鼠OX40稳定表达细胞株的构建及其对B细胞促分化作用的研究[J]. 细胞与分子免疫学杂志， 2005， 21（6）: 767-771.

　　[5] Song A， Song J， Tang X， et al. Cooperation between CD4 and CD8 T cells for antitumor activity is enhanced by OX40 signals[J]. Eur J Immunol， 2007， 37(5): 1224-1232.

　　[6] Bansal P， Jember AG， Groft M. Signaling through OX40(CD134) breaks peripheral Tcell tolerance[J]. Nat Med， 2001， 7(8): 907-912.

　　[7] Hori T. Roles of OX40 in the pathogenesis and the control of diseases[J]. Int J Hematol， 2006， 83(1): 17-22.

　　[8] Taylor L， Schwarz H.Identification of a soluble OX40 isoform: development of a specific and quantitative immunoassay[J]. Immunol Methods， 2001， 255(1-2): 67-72.