AdPUMA联合SU5416对裸鼠胰腺癌生长和转移的抑制作用

【摘要】 目的：研究重组腺病毒(Ad)PUMA联合SU5416对裸鼠胰腺癌生长和转移的抑制作用。 方法： 建立裸鼠胰腺癌AsPC1细胞株原位移植瘤模型，将胰腺癌裸鼠随机分为4组，于模型的第14天，分别自腹腔注射生理盐水100 μL(对照组，n=8)、AdPUMA 3×108pfu/100 μL (PUMA组，n=10)、SU5416制剂16 mg/kg (SU5416组，n=9)和AdPUMA+SU5416 3×108pfu/100 μL + SU5416 16mg/kg (联合组，n=10)。治疗2周后处死裸鼠，剖腹测量原位肿瘤瘤重、抑瘤率、肿瘤微血管密度、胰腺癌细胞凋亡指数，同时观察腹膜、肝脏及毗邻脏器转移和腹水情况。结果：对照组、PUMA组、SU5416组、联合组诱发肿瘤瘤重分别为(0.72±0.08)、(0.48±0.06) 、(0.52±0.07)、(0.21±0.04)g，抑瘤率分别为0、28%、34%、71%，肿瘤微血管密度分别为21.4±2.7、20.2±2.5、8.3±1.6、3.8±1.0，凋亡指数分别为(2.7±1.8)、(13.7±3.4)、(5.5±3.7)、(20.6±8.6)%，腹膜转移率分别为87%、70%、33%、10%，肝转移率分别为75%、50%、22%、0，联合组与对照组比较差异有统计学意义(P均&<0.05) 。 结论： AdPUMA联合 SU5416具有协同抗胰腺癌作用。

【关键词】 胰腺肿瘤;肿瘤转移;生长抑制物

　　 ABSTRACT] Objective: To study the inhibitive effects of AdPUMA combined angiogenesis inhibitor SU5416 on pancreatic cancer growth and metastasis in athymic mouse. Methods： The pancreatic carcinoma athymic mouse model with AsPC1 cell strain orthotopic transplantation was established. The mice were randomly pided into 4 groups to receive peritoneal cavity injection at the 14th day separately with: Normal saline (control， n=8)， AdPUMA 3×108pfu/100 μL (PUMA group， n=10)， SU5416 16mg/kg(SU5416 group， n=9) and AdPUMA+SU5416 (combined group， n=10). Mice were killed after 2 weeks treatment. Tumor weight， inhibition rates， intratumoral microvessel density (MVD) and apoptotic index (AI) were measured， meanwhile， abdominal membrane， liver and adjacent organic metastasis and ascites were observed. Results： Tumor weights were (0.72±0.08)g，(0.48±0.06)g ，(0.52±0.07)g，(0.21±0.04)g， in 4 groups respectively; the inhibitive rates were 0.28%，34%，71% respectively; the intratumoral microvessel densities (MVD) were 21.4±2.7，20.2±2.5，8.3±1.6，3.8±1.0 respectively; The apoptotic indexes (AI) were (2.7±1.8)%，(13.7±3.4)%，(5.5±3.7)%，(20.6±8.6)% respectively; Peritoneal metastasis rates were 87%，70%，33%，10%， and liver metastasis rates were 75%，50%，22%，0 (P&<0.05). There was significant difference between combined group and control (P&<0.05). Conclusion： AdPUMA combined with SU5416 inhibits the pancreas cancer growth and metastasis in mouse.

　　[KEY WORDS] Pancreatic neoplasm;　 Metastasis;　Growth inhibitors

　　研究发现，p53正向凋亡调控因子(PUMA)基因表达能促进体内外胰腺癌细胞凋亡并抑制其生长，而对胰腺癌的转移和血管生成无明显影响[1，2]。SU5416是新合成的血管表皮生长因子受体Flk1/KDR酪氨酸激酶的抑制剂[3]，可抑制依赖于血管表皮生长因子刺激的血管表皮细胞增殖，但对肿瘤细胞无直接作用[4]。本文旨在研究重组腺病毒(Ad)PUMA联合SU5416对裸鼠胰腺癌生长和转移的抑制作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　胰腺癌AsPC1细胞株(上海细胞研究所)，裸鼠(上海动物研究所)，AdPUMA(由苏州大学第一附属医院张克君博士赠送)，SU5416(美国SUMB)，其他试剂为国产纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 裸鼠胰腺癌原位模型的建立及分组 AsPC1细胞株于DMEM培养液中稳定传代5～6代。观察细胞增殖旺盛时终止培养，用无血清DMEM培养液制备细胞悬液，调整细胞密度至1×1010/L备用。以40 mg/kg戊巴比妥钠裸鼠腹腔注射，取腹部正中切口，牵出胰腺，于脾门较宽大处胰腺背膜下注射1×106/L AsPC1细胞悬液后常规关腹。于术后第14天分别腹腔内注射生理盐水100 μL(对照组，n=8)、AdPUMA 3×108pfu/100 μL (PUMA组，n=10)、SU5416制剂16 mg/kg (SU5416组，n=9)和AdPUMA+SU5416 3×108pfu/100 μL + SU5416 16 mg/kg (联合组，n=10)。治疗14 d后剖杀裸鼠，切除原位肿瘤，检测各种指标。

　　1.2.2 检测指标 (1)瘤重和抑瘤率：测量大鼠原位肿瘤重量(W)，并计算抑瘤率=[(对照组W实验组W)/对照组W×100%]。(2)肿瘤细胞微血管密度(MVD)：用40倍光镜扫视整个切片，寻找高血管密度区(即“热点”)，在200倍光镜视野下，计算被CD34抗体染成棕色的血管数目，结果用3个200倍视野下的血管数目的平均数表示。(3)肿瘤细胞凋亡指数：采用DNA末端原位标记染色法检测细胞凋亡，以细胞核呈棕色者为凋亡细胞。在400倍视野下随机选取5个癌区，计算凋亡细胞在全部癌细胞中的比例。凋亡指数(AI)=(凋亡细胞数/癌细胞总数)×100%。(4)大鼠胰腺癌转移及腹水出现情况：将大鼠腹膜、肝脏及毗邻脏器切除，标本以10%甲醛固定、包埋后行HE染色，作组织病理学检查，同时观察大鼠腹水出现的情况。

　　2 结果

　　2.1 AdPUMA及SU5416对肿瘤瘤重和抑瘤率的作用

　　对照组、PUMA组、SU5416组、联合组瘤重分别为(0.72±0.08)、(0.48±0.06)、(0.52±0.07)、(0.21±0.04)g，抑瘤率分别为0、34%、28%、71%，联合组瘤重明显低于其它3组，抑瘤率明显高于其它3组，差异均有统计学意义(P&<0.05)。

　　2.2 AdPUMA及SU5416对肿瘤细胞微血管密度的影响

　　光镜下观察，联合组、SU5416组肿瘤血管内皮细胞处于静止状态，癌细胞无增殖，无新生血管生成;对照组、PUMA组则见癌细胞呈腺管样分布、腺腔大小不一、核异型明显、有缺乏周细胞且基底膜不完整的肿瘤新生血管的生成。联合组、SU5416组肿瘤微血管密度[分别为(3.8±1.0)、(8.3±1.6)]明显低于PUMA组(20.2±2.5)、对照组(21.4±2.7)(P均&<0.05)，PUMA组与对照组比较差异无统计学意义(P&>0.05)。

　　2.3 AdPUMA及SU5416对肿瘤细胞凋亡的影响

　　光镜下观察，各实验组有胞膜及胞质枯缩、线粒体及核糖体聚集、胞核碎裂等细胞凋亡的形态特征，同时有细胞固缩染色质脱落的凋亡小体形成(图1)。对照组、PUMA组、SU5416组与联合组肿瘤细胞凋亡指数分别为(2.7±1.8)、(13.7±3.4)、(5.5±2.7)、(20.6±8.6)%，联合组、SU5416组与PUMA组比较差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　2.4 AdPUMA及SU5416对大鼠胰腺癌转移的抑制作用

　　对照组诱发的大鼠胰腺癌质地硬，肿块100%向四周浸润并形成癌性粘连，与对照组相比，联合组和SU5416组腹膜、肝、毗邻脏器转移率和形成腹水率均明显下降(P&<0.05)，PUMA组转移无明显改变(P&>0.05)，联合组和SU5416组比较，转移无明显改变(P&>0.05)(表1)。表1 AdPUMA和SU5416对裸鼠胰腺癌转移的抑制作用

　　3 讨论

　　PUMA是Bcl2蛋白家族中的一员，是p53下游基因。PUMA不影响细胞周期，它通过线粒体途径诱导快速细胞凋亡，具有强大的促凋亡作用。PUMA最大的优点是能被p53快速诱导，具有比p53更快的速度促进细胞凋亡，而且，PUMA发挥作用可以不依赖于p53的存在，这就为外源导入p53诱导凋亡效果不佳的肿瘤提供了基因治疗靶点，在一定程度上拟补了p53治疗的缺陷。我们前期对PUMA的作用及机制进行了系统研究，证实PUMA通过促凋亡作用抗胰腺癌肿瘤生长[1，2]。PUMA基因特点是通过促进细胞凋亡来抑制胰腺癌肿瘤生长，对胰腺癌转移和血管生成不产生明显影响，而胰腺癌是高侵袭的恶性肿瘤，单一PUMA基因对胰腺癌治疗的效果仍不理想。 实验表明，SU5416可抑制依赖于血管表皮生长因子刺激的血管表皮细胞增殖，但对肿瘤细胞无直接作用[3]。本实验结果表明，SU5416通过抑制胰腺癌肿瘤血管生成而抑制胰腺癌生长，但对细胞凋亡影响不明显。SU5416能阻断来自细胞外血管生长刺激信号和已激活信号的转化通路，有效地抑制血管表皮生长因子的活性，从而降低肿瘤细胞的微血管密度，使肿瘤处于单纯扩散的无血管生成状态，从而抑制其生长。

　　本研究发现，AdPUMA和SU5416联合应用，胰腺癌肿瘤的生长明显被抑制，效果优于单独AdPUMA和SU5416的作用，说明SU5416与AdPUMA的联合应用有协同作用，可增加临床抗癌药的疗效，符合对肿瘤细胞生长、转移互补性抑制的原则。

参考文献

1 张克君，李德春，朱新国.外源野生型正向细胞凋亡调控因子基因对人胰腺癌细胞生长的作用[J].中华消化杂志，2006，26(11):778779.

　　2 张克君 ， 李德春.p53正向凋亡调节因子(PUMA)重组腺病毒载体的构建及对体内外胰腺癌的作用[J].中华微生物学与免疫学杂志，2009，28(1):126128.

　　3 Mendel DB，Laird AD，Smolich BD，et al.Development of SU5416，a selective small molecule inhibitor of VEGF receptor tyrosinekinase activity，a sanantiangiogenesis agent[J].Anticancer Drug Des，2000，15:2941.

　　4 Fong TA，Shawver LK，Sun L，et al.SU5146 is a potent and selective inhibitor of the vascular endothelial growth factor receptor (Flk1/KDR)that inhibits tyrosinekinase catalysis，tumor vascularization，and growth of multiple tumor types[J].Cancer Res，1999，59:99106.