胃癌组织中化学趋化因子mRNA表达与TAM、MC计数的相关性研究

　　　　　　 作者：秦启翻 许干新 ，符正豪

【摘要】 目的：研究胃癌组织中白细胞介素8(IL8)mRNA、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)mRNA和巨噬细胞炎性蛋白 1α(MIP1α)mRNA表达水平及肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、肥大细胞(MC)计数，探讨它们之间的相互关系及临床病理意义。方法：51例胃癌常规制作石蜡包埋切片， 应用原位杂交方法检测胃癌组织IL8mRNA、MCP1mRNA和MIP1α mRNA的表达水平，并应用免疫组化方法测定胃癌组织TAM和MC计数，比较不同临床、病理特征胃癌患者3种趋化因子的表达及TAM、MC计数，并比较IL8mRNA、MCP1mRNA、MIP1 α mRNA不同表达者TAM和MC计数。结果：高、中分化及Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移、浸润深度T1+T2患者IL8mRNA、MCP 1mRNA、MIP1α mRNA阳性表达率及TAM和MC计数明显低于低、未分化及Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移、浸润深度T3 +T4者(P&<0.01);IL8mRNA、MCP1 mRNA和MIP1 αmRNA阳性表达病例TAM、MC计数均明显高于阴性病例(P&<0.01)。结论：IL8、MCP1和MIP1α 3种化学趋化因子mRNA及TAM、MC计数可作为反映胃癌进展、生物学行为和预后的重要标志物， 3种化学趋化因子mRNA均能促进癌基质中TAM、MC浸润和迁移。

【关键词】 胃癌;化学趋化因子类;肿瘤相关巨噬细胞;肥大细胞;原位杂交　;免疫组织化学

　　 [ABSTRACT] Objective: To determine relations of expressions of IL 8 mRNA， MCP 1 mRNA， MIP 1α mRNA and the counts of TAM and MC in gastric carcinoma and clinical pathological significance. Methods: Expression levels of IL8mRNA， MCP1mRNA and MIP1α mRNA were determined using in situ hybridization in paraffinembedded sections of samples of 51 patients with gastric cancer， and TAM and MC counts of the samples of gastric cancer were determined by immunohistochemistry. Expression levels of IL8mRNA， MCP1mRNA and MIP1α mRNA， and counts of TAM and MC were compared according to different clinical and pathological features of gastric cancer， and relations between expression levels of IL8mRNA， MCP1mRNA and MIP1α mRNA and different counts of TAM and MC were studied. Results: Positive expression rates of IL8mRNA， MCP1mRNA， MIP1α mRNA and counts of MC and TAM in patients of high and medium degree differentiation， clinical stageⅠ+Ⅱ， no lymph node metastasis， and infiltration of T1 + T2 were significantly lower than those low degree differentiation and undifferentiation， clinical stage Ⅲ + Ⅳ， lymph node metastasis， and infiltration of T3 + T4(P&<0.01); counts of TAM and MC in cases of positive expression of IL8mRNA， MCP1 mRNA and MIP1α mRNA were significantly higher than those in negative cases (P&<0.01 ). Conclusion: Chemokines of IL8mRNA， MCP1mRNA and MIP1α mRNA can promote infiltration and migration of TAM and MC in gastric carcinoma， which and counts of TAM and MC may be important markers of the biological behavior， progress and prognosis of gastric carcinoma.

　　[KEY WORDS] Gastric carcinoma; Chemokines; Tumorrelated macrophage; Mast cell; In situ hybridization ; Immunohistochemistry

　　研究发现一些趋化因子表达与恶性肿瘤进展、血管生成、转移发生及预后有密切关系[1]。近年研究发现恶性肿瘤组织中浸润的巨噬细胞即肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociated macrophage，TAM)数量及肥大细胞(mast cells，MC)浸润数量与恶性肿瘤进展、血管生成及预后也有密切关系[26]。本研究应用原位杂交方法检测胃癌组织白细胞介素8(IL8)mRNA、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)mRNA和巨噬细胞炎性蛋白 1α(MIP1α )mRNA的表达水平，并应用免疫组化方法测定胃癌组织TAM和MC计数，以探讨其临床病理意义及其相互关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　收集本院普外科2007年1月～ 2008年11月行胃癌根治术的胃癌及转移淋巴结标本51例，所有患者术前均未行抗肿瘤治疗。其中男性27例，女性24例，年龄32～84岁，中位年龄62岁。高、中分化19例，低分化32例;无淋巴转移33例，有淋巴转移18例，肝转移4例;Ⅰ+Ⅱ期25例，Ⅲ+Ⅳ期26例。51例均经手术、病理检查证实。

　　1.2 方法

　　标本经4%甲醛固定后常规制作石蜡包埋切片，切片厚4μm。(1) IL8mRNA、MCP1mRNA和MIP1α mRNA采用原位杂交法进行染色，具体步骤参照试剂盒说明(IL8mRNA、MCP1mRNA和MIP1α mRNA原位杂交试剂盒及AEC显色试剂盒购自武汉博士德公司)。以切片中阳性细胞率≥25%为阳性， &< 25%者为阴性;以博士德公司提供的阳性切片作为阳性对照，以原位杂交专用PBS液替代杂交液作为阴性对照。(2)TAM和MC采用EnVisionTM免疫组化法进行染色，具体步骤参照试剂盒说明(鼠抗人CD68和色胺酶单克隆抗体购自北京中杉生物技术公司， EnVisionTM染色试剂盒购自上海基因生物技术公司)。细胞质和(或)细胞核中含棕黄色颗粒者为阳性细胞， TAM和MC计数方法:选低倍光镜下5个含TAM和MC数量最多的区域，高倍镜下计数5个视野内TAM和MC数量，其均值为TAM和MC计数;以北京中杉生物公司提供的阳性切片作为阳性对照，以0.01mol/L PBS液替代一抗作为阴性对照。

　　1.3 统计学处理

　　所得数据采用SPSS15.0统计软件包进行统计学处理，数据的比较采用χ2 检验或t检验、F检验及Fisher's精确概率法，检验水准a=0.05。

　　2 结果

　　51例胃癌IL8mRNA、MCP1mRNA 和MIP1α mRNA表达阳性病例分别为29例(56.9% )、28例(54.9% )和30例(58.8% )，TAM和MC计数均值分别为(14.8 ±5.2)个/Hp和(6.8 ±2.4)个/Hp。高、中分化及Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移、浸润深度T1+T2患者IL8mRNA、MCP 1mRNA、MIP1α mRNA阳性表达率及TAM和MC计数明显低于低、未分化及Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移、浸润深度T3 +T4者(P&<0.01) ，见表1。IL8mRNA、MCP1αmRNA和MIP1α mRNA阳性表达患者TAM、MC计数明显高于表达阴性者(P&<0.01)，见表2。秦启翻等.胃癌组织中化学趋化因子mRNA表达与TAM、MC计数的相关性研究 表1 不同临床、病理特征胃癌患者IL8mRNA、MCP1mRNA和MIP1α mRNA的阳性表达及TAM、MC计数表2 3种超化因子不同表达者TAM和MC计数的比较

　　3 讨论

　　肿瘤细胞转移扩散至区域淋巴结的分子机制尚未明了。越来越多的证据表明，肿瘤转移是一个复杂的、连续的、多阶段的过程，并表现出高度的特异性、非随机性和器官选择性，能够转移到特定器官的恶性肿瘤细胞均具有多种机制促进它们侵袭组织，增强其生长繁殖能力。趋化因子是一种能够结合至靶细胞上特异性G蛋白耦联受体的化学诱导因子，其参与调节生理性和病理性白细胞的迁移[7]。IL8、MCP1和MIP1α均为具有重要生理作用的化学趋化因子，当它们与其相应受体或配体结合后具有促进血管生成、炎性细胞浸润及基质蛋白酶生成等作用[1] 。近年研究发现许多恶性肿瘤可合成和分泌IL8、MCP1和MIP 1α等趋化因子，而其相应来源的正常细胞或良性肿瘤无此自分泌作用，且阳性表达的患者血清趋化因子含量也明显升高。进一步研究发现， IL8、MCP1和MIP1α及其mRNA表达与恶性肿瘤进展、血管生成、转移发生、侵袭能力及其预后密切相关，阳性表达者进展快、血管生成密度高、易发生转移、侵袭能力强及预后差，其机制可能为肿瘤细胞分泌的趋化因子与相应受体结合后能促进基质炎性细胞浸润、肿瘤血管生成、癌基质蛋白降解及影响癌细胞生物学行为等有关，但其确切机制仍需进一步研究[2]。本组资料发现，部分胃癌可合成和分泌IL8mRNA、MCP1mRNA和MIP1αmRNA，且高、中分化及Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移、浸润深度T1+T2患者IL8mRNA、MCP 1mRNA、MIP1α mRNA阳性表达率及TAM和MC计数明显低于低、未分化及Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结转移、浸润深度T3 +T4者，提示3种趋化因子mRNA表达水平与胃癌进展、转移、侵袭能力及预后密切相关。

　　巨噬细胞是单核巨噬细胞系统内某个时期的分化类型，是肿瘤间质中炎性细胞浸润的一个关键成分，单核巨噬细胞在癌间质内通常分化为TAM，与肿瘤血管生成关系密切[2， 3]。文献报道TAM除与肿瘤血管生成有关外，其癌基质内浸润的数量与恶性肿瘤进展、转移及预后也存在密切关系， TAM计数高者进展快、易发生转移及预后差， TAM可作为恶性肿瘤预后评估的客观指标[2，3] 。MC来源于骨髓造血干细胞，常沿血管或淋巴管分布，其胞质内充满异染颗粒。MC可合成和分泌40 余种生物活性物质，这些生物活性物质不仅能直接引起反应，还可间接诱导邻近细胞释放一些其他介质，进一步扩展组织反应。近几年有学者采用异染特殊染色或色胺酶免疫组化法研究了良、恶性肿瘤组织中MC数量变化及其生物学意义，发现MC计数与恶性肿瘤生物学行为、转移发生及其预后密切相关，MC计数高者多恶性度高、血管生成密度高、易发生转移、侵袭能力强和预后差[4～6] 。本组资料研究结果与文献报道较一致，提示TAM和MC计数可能是反映胃癌进展、生物学行为和预后的重要生物学指标。Pellegriuo等[1]研究发现化学趋化因子与多种炎性细胞癌间质浸润和迁移呈密切正相关，本组研究结果显示IL 8 mRNA、MCP  1mRNA和MIP1αmRNA阳性表达胃癌TAM、MC计数明显高于其相应的阴性病例，说明胃癌组织中自分泌的IL8、MCP1和MIP1α具有诱导TAM和MC向癌基质中浸润和迁移作用， 其机制与3 种趋化因子生物学作用有关。

参考文献

1 Pellegriuo A，Yacca A，ScavelliC，et al.Chemokines and tumors[J].Recentiprog Med，2002，99(1):642654.

　　2 Chen JJ，Yao PL，Yuan A，et al. Upregultion of tumor interleukin8 expression by infiltrating macrophages: its correlation with tumor angiogenesis and patient survival in non small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2003，9(2):729737.

　　3 Guo SJ， Lin DM， LiJ， et al. Tumorassociated marcrophages and CD 3zeta expression of tumorinfiltrating lymphocytes in human esophageal squamouscell carcinoma[J]. Dis Esophageus， 2007， 20(2):107116.

　　4 Aydin O， Dusmez D， Cinel L， et al. Immunohistological analysis of mast cell number in the intratumoral and peritumoral regions of p rostate carcinoma. Compared to benign prostatic hyperp lasis[J]. Pathol Res Pract ，2002，198(3):267274.

　　5 Molin D， Edstrom A， Glimelius I，et al.Mast cell infiltration correlates with poor prognosis in Hodgkin's lymphoma[J]. Br J Haematal，2002，19(1):122124.

　　6 Ozdemir O. Mast cells and the tumorassociated neoangiogenesis[J].Med Sci Monit， 2006，12(6):LE911.

　　7 Nathanson SD. Insights into the mechanisms of lymph node metastasis[J].Cancer，2003，98(2):413.