沉默ERCC1基因对卵巢癌细胞A2780顺铂耐药性的影响

　　　　 作者：孙业红， 陈富强， 朱莹， 李体远

【摘要】 目的： 研究RNA干扰切除修复交叉互补基因1(ERCC1)的表达后，卵巢癌细胞A2780对顺铂耐药性的变化。方法： A2780细胞分别转染ERCC1基因的siRNA和GFPsiRNA，并给予顺铂(使其终浓度达到3 μmol/L)，蛋白质印迹法分别检测顺铂给药前后ERCC1蛋白的表达，并用MTT法检测顺铂不同浓度下A2780细胞的存活率。结果： ①转染ERCC1 siRNA后，实验组蛋白质表达量较对照组显著降低;②ERCC1 siRNA+顺铂组的ERCC1蛋白表达要弱于ERCC1 siRNA+PBS组，而GFP siRNA+顺铂组的蛋白表达要弱于GFP siRNA+PBS组;③顺铂(浓度在0.75～12 μmol/L之间)呈浓度依赖性地降低A2780细胞的存活率;④在相同浓度顺铂的作用下，与GFPsiRNA组相比，ERCC1siRNA组的顺铂量效曲线左移。结论： 顺铂能抑制沉默ERCC1基因后A2780细胞的生长，且在一定浓度范围内呈浓度依赖性;ERCC1是参与顺铂耐药性产生的重要因素之一。

【关键词】 RNA干扰; 切除修复交叉互补基因1; 顺铂; 耐药性; 卵巢癌

　　[Abstract] Objective: To investigate the influence of RNA interfering the expression of excision repair crosscomplementing 1(ERCC1) gene on the sensitivity of ovarian cancer cell A2780 to Cisplatin.Methods： SiRNA and GFP siRNA was transfected to knock out ERCC1 gene instantaneous and make a control manner respectively. Cisplatin(final concentration of 3μmol/L) was given to the knockouted cells. Western blot was taken for the analyses of ERCC1 protein expression in A2780 cells before and after Cisplatin was given. Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)colorimetric assay were used to determine the livability of the cancer cells in different Cisplatin concentration. Results： ①After transfection of ERCC1 siRNA，The results showed the ERCC1 protein expression level of control group was significantly higher than that of experimental group; ②ERCC1 siRNA+Cisplatin group and GFP siRNA+Cisplatin group expressed less ERCC1 protein than ERCC1 siRNA+PBS group and GFP siRNA+PBS group respectively;③Cisplatin(at the concentration of 0.75～12μmol/L)inhibited the livability of A2780 cells in a dosedependent manner in despite of siRNA; ④At a same concentration of Cisplatin， the doseeffect curve of knockout group was left to that of control group. Conclusion： Cisplatin inhibited the proliferation of A2780 cells in a dosedependent manner in despite of siRNA; ERCC1 is one of the important reasons of Cisplatin resistance in A2780 cell.

　　[Key words] RNA interference; excision repair crosscomplementing 1 gene; Cisplatin resistance; ovarian cancer

　　顺铂[cisDiamminedichloroplatinum(Ⅱ)，Cisplatin，CDDP]是卵巢癌等癌症治疗中使用最为广泛的化疗药物之一。顺铂通过使肿瘤细胞形成DNA加合物，造成肿瘤细胞的DNA损伤，继而使肿瘤细胞DNA的复制被抑制，细胞分裂再生停止，最终杀灭肿瘤细胞。然而，顺铂的疗效会因癌细胞内在或者后天(药物诱导)获得的耐药性而减弱。到目前为止，对顺铂的体内耐药机制并不完全清楚，但是其中核苷酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)途径对铂类药物形成的DNA加合物的切割修复在肿瘤对铂类药物的耐药过程中起着非常重要的作用[1]。

　　NER修复路径有多种因子参与，切除修复交叉互补蛋白1(excision repair crosscomplementing protein 1，ERCC1)在其中起着决定性作用[2-4]。ERCC1对DNA损伤的识别功能、ERCC1的酶切割活力对肿瘤细胞的DNA损伤修复能力和铂类药物耐药都具有重要影响[5]。本研究应用RNA干扰(siRNA)技术沉默ERCC1基因，探讨在顺铂作用下，卵巢癌细胞株A2780 ERCC1基因表达的变化，以建立一个ERCC1缺损细胞模型，为进一步研究ERCC1在肿瘤耐药中的作用机制奠定基础;同时探讨沉默ERCC1基因后，顺铂对卵巢癌细胞株A2780细胞的损伤作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　人卵巢癌细胞株A2780购自中国典型培养物保藏中心。RMPI 1640液体培养基购自Hyclone公司，OptiMEMⅠ无血清培养基、脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000购自Invitrogen 公司，胎牛血清购自奥地利PAA公司，ERCC1 siRNA168(siRNA)由Invitrogen 公司合成，GFP siRNA为香港理工大学马克威博士惠赠，兔抗人ERCC1抗体(货号sc10785)为Santa Cruz公司产品，鼠源抗α微管蛋白单抗(T9026)、顺铂购自美国Sigma公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Beyotime公司。其他试剂均为进口分装或国产分析纯。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 A2780细胞培养 A2780细胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(内含100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素)，在37°C，5%CO2的恒温孵箱中培养。

　　1.2.2 转染siRNA 针对ERCC1基因的siRNA通过Invitrogen网站设计，并由Invitrogen公司合成。序列(5′→ 3′)：(RNA)AUCGGAAUAAGGGCUUGGCTT。将稀释的siRNA与稀释的Lipofectamine 2000混合，室温下孵育15 min，形成siRNA脂质体复合物。吸去A2780细胞培养基，用PBS洗一遍，每孔加入650 μl的无血清OptiMEM，加入150 μl上述复合物，在 37℃，含5%CO2的恒温孵箱中培养4 h。然后加入含30%FBS的OptiMEM 400 μl培养16 h以上。对照组中则使用GFPsiRNA。

　　1.2.3 蛋白质印迹分析 在细胞转染24 h后收集6孔板中的细胞，-20℃保存备用。BCA法测定蛋白的浓度，酶标仪测定570 nm处的D值，根据量效曲线计算出样品的蛋白浓度。取出-20℃冻存蛋白裂解液100 μl与 6×加载缓冲液20 μl混合，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，转膜，封闭后，将膜和一抗(ERCC1抗体，1∶500稀释)一起孵育4℃过夜，TBST洗膜，加二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色，于相对分子质量为33 000处观察ERCC1蛋白的表达条带。以α微管蛋白作内参，图片以Bandscan软件分析条带光密度。

　　1.2.4 顺铂对沉默ERCC1基因后A2780细胞ERCC1蛋白表达的影响 转染siRNA 6 h后，给予顺铂(使其终浓度为3 μmol/L)。18 h后以蛋白质印迹法检测ERCC1的蛋白表达。步骤同“1.2.3”。本实验设两个实验组：①ERCC1 siRNA+顺铂组，②GFP siRNA+顺铂组。每个实验组相应的对照组为①ERCC1 siRNA+PBS组，②GFP siRNA+PBS组。

　　1.2.5 顺铂致A2780细胞损伤实验(MTT法测定细胞存活率) 顺铂用不含Mg2+的PBS配制成0.1%的母液，再稀释至所需浓度。根据前期实验研究，顺铂对于A2780的半数有效抑制浓度IC50为0.75 μmol/L。本实验共设置5个浓度：0.75，1.5，3，6和12 μmol/L。MTT检测随机分成3个实验组：①ERCC1 siRNA+ 顺铂组(转染ERCC1 siRNA，分别给予不同浓度的顺铂);②GFP siRNA+顺铂组(转染GFP siRNA，分别给予不同浓度的顺铂);③空白+顺铂组(未加转染试剂，分别给予不同浓度的顺铂);相应的3个对照组为：①ERCC1 siRNA+PBS组(转染ERCC1siRNA，给予PBS);②GFP siRNA+PBS组;③空白+PBS组。

　　细胞接种于96孔板上培养24 h后更换含10%FBS的RMPI 1640培养基，如“1.2.2”方法转染siRNA，24 h后更换培养基，再向培养液中加入不同浓度的顺铂，对照组加入相同体积的PBS，各组均设3个复孔。 给药24 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续孵育4 h后终止培养，吸弃培养上清液，每孔加入150 μl DMSO，恒温振荡器上振荡10 min，酶联免疫检测仪570 nm波长处测定各孔光密度值，记录结果。

　　细胞存活率=实验组D值对照组D值×100%

　　1.2.6 数据统计 数据用±s表示，资料采用Oneway ANOVA结合NewmanKeuls检验分析各组间差异。P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 蛋白浓度测定

　　在波长570 nm处测定各个标准液的光密度，绘制标准曲线，获得量效关系曲线公式并计算出样品的浓度值，以保证蛋白上样量的一致性。

　　2.2 A2780细胞ERCC1基因沉默效率鉴定

　　图1内参α微管蛋白的蛋白质印迹结果显示，与标准参照物相比，在第2，3泳道的相应位置都出现了大约55 000大小的条带，其位置与预期的条带符合。经Bandscan软件分析，A，B两个条带的灰度无明显差异。图1中ERCC1结果显示，A，B两个泳道都在相同位置(约35 000)处出现特异性条带(ERCC1)。A带(ERCC1 siRNA组)是B带(GFP siRNA组)亮度的75.31%。

　　2.3 沉默ERCC1基因后A2780细胞ERCC1蛋白表达的变化

　　图2中内参α微管蛋白的蛋白质印迹结果显示，与标准参照物条带相比，在A，B，C，D的相应位 置都出现了大约55 000大小的条带，其位置与预期的条带符合，且A，B，C，D 4个条带的灰度无明显差异。图2中ERCC1结果显示，B，C，D亮度分别为A的55.32%，65.97%，97.63%，这表明实验组与对照组相比较，两实验(顺铂)组的ERCC1蛋白表达均要弱于对照(PBS)组;两实验组间比较，ERCC1 siRNA+顺铂组的ERCC1蛋白表达弱于GFP siRNA+顺铂组。

　　2.4 顺铂降低A2780细胞存活率

　　MTT法测定细胞活力结果发现，顺铂(0.75～12 μmol/L)呈浓度依赖性地降低A2780细胞存活率。顺铂在0.75 μmol/L时，转染ERCC1 siRNA，GFP siRNA，空白3个实验组中的细胞存活率分别为相应对照组(给予PBS)的80.94%，86.53%和90.38%(P&<0.05，差异有统计学意义)。随着顺铂浓度的增高，细胞的死亡率增加，当顺铂浓度增加至12 μmol/L时，3个实验组中的细胞存活率分别降至相应对照组的46.27%，53.79%和44.16%(P&<0.01，差异有统计学意义)。结果均说明顺铂具有抑制A2780细胞生长的作用，且在一定的浓度范围内呈浓度依赖性。见图3。

　　2.5 沉默ERCC1基因增强顺铂致A2780 细胞损伤的作用

　　如图4所示，在顺铂同一浓度，与GFP siRNA组相比，ERCC1 siRNA组的量效曲线左移，说明顺铂抑制细胞生长的作用，基因沉默组要强于未沉默组;而与GFP siRNA组相比，空白组的量效曲线右移。当顺铂浓度为3，6或12 μmol/L时，与ERCC1 siRNA组相比，GFP siRNA组细胞存活率分别增加11.62%，14.41%和7.33%(P&<0.05，有统计学意义)。这说明，转染ERCC1基因的siRNA后，细胞对于CDPP的耐受功能明显降低，ERCC1基因的沉默导致A2780细胞对CDPP更为敏感。

　　3 讨 论

　　核苷酸切除修复是DNA修复机制中的一条重要途径。它主要修复累积性损伤，涉及DNA双螺旋结构受损、紫外线导致的嘧啶二聚体、大分子致癌物导致的DNA加合物等DNA 链上较大损伤。NER的机制较为复杂，涉及许多功能蛋白的相互作用[6，7]。其修复方式有两种[8]：①转录耦联修复(transcriptioncoupled NER，TCR);②全基因组修复(global genome NER，GGR)。与NER相关的基因有8种，其中ERCC1研究得最多。ERCC1基因位于染色体19q13.2～19q13.3，全长15 kb，含10个外显子，编码含297个氨基酸的蛋白质，相对分子质量为32 500[9]。

　　关于卵巢癌铂类耐药与ERCC1 相关性的研究较多。Dabholkar等[10]的研究表明，接受过顺铂化疗的晚期卵巢癌患者肿瘤组织中ERCC1，XPB，XPA，CSB 均表达增高，而仅ERCC1 mRNA 表达与顺铂化疗疗效之间存在显著相关性。对42例经顺铂化疗的卵巢癌患者的研究发现，化疗耐药组ERCC1基因的阳性表达率明显高于化疗敏感组，前者为77.3%，而后者为35.0%，表明ERCC1表达的增高与顺铂耐药相关[11]。在卵巢上皮癌组织中， ERCC1表达存在肿瘤异质性。在周期性化疗中，顺铂化疗主要杀伤ERCC1阴性表达的肿瘤细胞，而ERCC1阳性表达的肿瘤细胞则对顺铂不敏感[11]。

　　本研究表明，随着顺铂用药剂量的增加，细胞的死亡增多，说明在一定浓度范围内，顺铂抑制ERCC1基因沉默和未沉默ERCC1基因的A2780细胞生长的作用均呈剂量依赖型;沉默卵巢癌细胞系A2780的ERCC1基因后，ERCC1的损伤修复功能明显受损，细胞对铂类药物的敏感度上升，耐药性降低，进一步说明ERCC1是参与顺铂耐药性产生的重要因素之一。至于与GFP siRNA组相比，空白组的量效曲线右移，这是因为转染试剂本身的轻微毒性作用所致。转染ERCC1 siRNA后，细胞对于药物的耐受功能明显降低，这一方面佐证了ERCC1基因在肿瘤细胞耐药中的重要作用，另一方面也提示ERCC1 siRNA的沉默效果明显。因此本方法是简便易行的瞬时ERCC1基因剔除法，可进一步应用于ERCC1基因功能的深入研究。

　　ERCC1 可能成为卵巢癌潜在的基因治疗靶点。临床前期实验证明，顺铂可以提高ERCC1的表达从而产生耐药。那么相反，变异的ERCC1表达可以增加顺铂的敏感性[5]。因此下一步工作将深入研究ERCC1基因变异对其功能的影响，探讨外显子在肿瘤耐药中的作用及其可能机制。

参考文献

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　　[3] LI Q， YU JJ， MU C， et al. Association between the level of ERCC1 expression and the repair of cisp latininduced DNA damage in human ovarian cancer cells[J]. Anticancer Res， 2000， 20(2A):645-652.

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　　[10] Dabholkar M， Thornton K， Vionnet L，et al. Increased mRNA levels of xeroderma pigmentosum completmentation group B(XPB) and Cockayne′s syndrome complementation group B(CSB) without increased mRNA levels of multidrugresistance gene(MDR1) or metallothioneinⅡ(MTⅡ) in platinumresistant human ovarian cancer tissues[J]. Biochem Pharmacol， 2000， 60(11): 1611-1619.

　　[11] 王会妍， 瞿全新. 卵巢上皮性癌ERCC1表达与顺铂化疗耐药关系的研究[J]. 现代妇产科进展， 2006， 15(7):512-514.