靶向ATP6L的RNA干扰抑制乳腺癌细胞的体外侵袭能力

　　　　 作者：游海燕， 金洁， 唐宁， 邓云， 舒惠群， 沈秋瑾， 覃文新

【摘要】 目的： 通过靶向ATP6L的RNA干扰抑制质子泵的功能，检测MCF7/ADR乳腺癌细胞的体外侵袭情况。方法: 采用有效ATP6L干扰片段及干扰对照分别转染MCF7/ADR细胞，通过荧光分光光度计检测BCECF与细胞分泌上清孵育后在不同激发光激发后发射的荧光量;用实时荧光定量PCR检测细胞中基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达情况;用明胶酶谱方法检测细胞分泌上清中的MMP2活性;用细胞侵袭实验(Transwell) 检测细胞体外侵袭能力。结果: 在MCF7/ADR细胞中，下调ATP6L基因的表达可以使细胞的泌H+能力减弱;细胞中MMP2表达水平无变化;细胞分泌上清中的MMP2活性减弱;细胞的体外侵袭能力下降。结论: 靶向ATP6L的RNA干扰可抑制质子泵的功能，从而抑制MCF7/ADR乳腺癌细胞的体外侵袭能力。

【关键词】 ATP6L; RNA干扰; 侵袭; 肿瘤

　　[Abstract] Objective: To explore whether the invasion of MCF7/ADR cells could be affected by in vitro inhibition of VATPase activity. Methods: The expression of ATP6L was knocked down by specific siRNA in breast cancer cell line， MCF7/ADR. Then the capability of proton extrusion was analyzed by detecting the extracellular pH of the supernatant using pHsensitive fluorescent dye BCECF on a luminescence spectrometer. The expression of MMP2 and activity of gelatinase were determinated by realtime fluorogentic quantitative PCR and zymography. The ability of cell invasion in vitro was tested by transwell assay. Results: Proton extrusion was decreased in MCF7/ADR cells treated with siRNAATP6L as compared with the control. There was no difference in the expression of MMP2 between siRNAATP6L treated group and control group. The gelatinase activity in the supernatant of MCF7/ADR cells treated with siRNAATP6L was decreased. The invasive ability of MCF7/ADR cells was inhibited by ATP6L knockdown. Conclusion: After knockdown of ATP6L expression， the invasion of MCF7/ADR cells was inhibited by the decrease of proton extrusion and the downregulation of gelatinase activity.

　　[Key words] ATP6L; RNA interference; invasion; cancer

　　人类对乳腺癌的发病及其发展过程有了进一步的认识，改变了过去认为乳腺癌只是局部疾病的观念。许多研究证实乳腺癌从起初发病时即表现为全身性疾病，而不仅仅是局部的肿瘤，且乳腺癌在早期即可发生血行播散。在美国，乳腺癌复发患者总的5年生存率为46%，远处转移率为51% [1，2]。乳腺癌肝转移的中位生存期仅为7～20个月[3]。复发和转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因[4]，术后防范复发对于乳腺癌患者来说尤为关键。有研究发现，质子泵(vacuolarH+ATPase， VATPase)在一些肿瘤中高表达[5]，并且通过向细胞外泌H+来促进肿瘤细胞的增生和侵袭[6]。

　　VATPase是一个由多个亚基组成的复合物。它主要有两个结构域，一个是位于细胞质的V1结构域(640 000);另一个是跨膜的V0结构域(260 000)[7，8]。V1结构域可以水解ATP供能，而V0结构域是质子转运的通道。V0结构域由a， d， e， c， c′， c″6种不同的亚单位组成。其中亚单位c， c′， c″是高度疏水的蛋白，也被称为蛋白脂亚单位。亚单位c， c′有4个跨膜螺旋，c″有5个跨膜螺旋。每个蛋白脂亚单位都包含一个质子转运所必需的羧基基团。本研究旨在通过靶向ATP6L(VATPase跨膜V0结构域中的c亚单位)的RNA干扰抑制质子泵的功能，达到抑制MCF7/ADR乳腺癌细胞的体外侵袭能力。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞及细胞培养

　　MCF7/ADR乳腺癌细胞株购自中国医学科学院天津血液学研究所，用含10%胎牛血清(FBS)及100 U/ml青霉素和100 ng/ml链霉素的RPMI1640培养液培养。MCF7/ADR细胞在含1 μg/ml的低浓度多柔比星的完全培养液中培养以保持细胞的耐药性。实验前，耐药细胞均要用无药物的培养液培养传代1周。

　　1.2 主要试剂与仪器

　　FBS和RPMI1640购自Gibco公司;Trizol、OptiMEMTM 2000试剂购自Invitrogen公司;SYBR PrimeScriptTM RTPCR 试剂盒及PrimeScriptTM RT试剂盒购自TaKaRa公司;BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司;Transwell小室(内径6.5 mm，孔径8.0 μm)购自Corning公司;MatrigelTM购自BD公司;结晶紫、考马斯亮蓝R250、BCECF及A型明胶购自Sigma公司;荧光分光光度计(LS 50B， Perkin Elmer公司);倒置荧光显微镜(TH4200，Olympus公司);实时PCR 系统(7300，ABI公司)。

　　1.3 siRNA合成

　　由上海吉玛公司化学合成经HPLC纯化的针对ATP6L的特异干扰片段及干扰对照片段(见表1)。在MCF7/ADR乳腺癌细胞中，转染siRNA2ATP6L及siRNA3ATP6L干扰片段可抑制内源性ATP6L的mRNA表达，抑制率高达90%以上[9]。

　　1.4 干扰片段转染细胞

　　将位于指数生长期的细胞接种于六孔板内，培养过夜，细胞密度达到30%左右。分别制备干扰片段和脂质体的混合物:取特异靶向ATP6L的干扰片段50 nmol/L溶解于250 μl的OptiMEMI中，取干扰对照片段50 nmol/L溶解于250 μl的OptiMEMI中。两者混合，室温放置20 min。细胞换用1ml无抗生素的含10%血清的1640培养液，将干扰片段和脂质体的混合物加入六孔板内。表1 靶向ATP6L及对照的siRNA序列

　　1.5 BCECF方法检测细胞外H+浓度

　　将指数生长期的MCF7/ADR细胞种于六孔板中，过夜后，细胞满度达到30%左右。然后分别转染特异的ATP6L的干扰片段及对照干扰片段。转染48 h后，更换细胞培养液，每孔中分别加入200 μl不添加碳酸氢钠的1640培养液，12 h后吸取上清液100 μl，然后于上清液中加入终浓度为1 μmol/L的BCECF氢离子敏感荧光探针，用荧光分光光度计分别检测在490 nm和440 nm光激发下535 nm的发射荧光量。然后计算出490 nm/440 nm激发下535 nm的发射光比值，此比值(FIR)与BCECF浓度无关而仅与pH相关[10]。实验证明，在pH 58范围内，FIR与pH呈线性关系。再由得到的细胞外pH值，转换成细胞外氢离子浓度。实验重复3次。

　　1.6 实时定量PCR检测MMP2的表达

　　将指数生长期的MCF7/ADR细胞种于六孔板中，过夜后，细胞满度达到30%左右。然后分别转染特异的ATP6L的干扰片段及对照干扰片段。转染48 h后，抽提细胞的总RNA。然后将RNA逆转录成cDNA，用MMP2的特异引物进行实时定量PCR反应。PCR引物采用在线软件Primer 3.0设计(http://wwwgenome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3.cgi);引物序列为MMP2L(5′3′) AGCTCCCGGAAAAGATTGAT，MMP2R(5′3′) GGTGCTGGCTGAGTAGATCC，引物由上海生工公司合成。PCR的反应条件:95 ℃预变性15 s，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40个循环;融解曲线条件为95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。置ABI 7300 PCR仪上进行反应。PCR完成后，经电脑自动分析，查看每个基因的扩增情况，导出相应的域值循环数，采用2-△△CT方法，以β肌动蛋白的表达作为内参，计算每个基因的相对表达量。对融解曲线分析以确定得到的扩增产物是否为单一的目的片段。

　　1.7 明胶酶谱法检测细胞分泌上清MMP2活性

　　将指数生长期的MCF7/ADR细胞种于六孔板中，过夜后，细胞满度达到30%左右。然后分别转染特异的ATP6L干扰片段及对照干扰片段。转染48 h后，换液成500 μl的无血清1640培养液，继续培养24 h，收上清。对上清中的蛋白用BCA试剂进行定量。每泳道上样20 μg上步操作中收集的细胞上清，行10%的SDSPAGE电泳。除在10%的SDSPAGE 电泳的分离胶中加入终浓度为1% 的A型明胶外，其他方法同蛋白质印迹法的电泳过程。电泳完毕后，取出凝胶，按以下步骤操作:①把胶置于1×洗脱液(25%Triton X100，V/V)，于摇床上室温缓慢振荡，洗两次，每次30 min。②倾倒洗脱液，把胶置于新鲜配制的1×孵育液(10×， 12.1 g Tris base， 63.0 g TrisHCl缓冲液， 117 g NaCl， 7.4 g CaCl2，0.2% Brij35， 用millQh3O定容至1 L)，置摇床上室温缓慢振荡30 min。③更换1×孵育液，将胶置于新鲜配制的1×孵育液里37 ℃孵育反应至少4 h。④将胶置于考马斯亮蓝R250中染色60 min，然后用脱色液脱色至深蓝背景中亮带出现，用凝胶成像分析系统处理软件对明胶酶谱结果进行灰度扫描。

　　1.8 体外侵袭实验

　　采用Transwell小室，按照以下步骤进行。①基质胶准备:将冻存于-20 ℃冰箱的Matrigel 放在4 ℃过夜，使其由凝固状变成液态; ②Matrigel用无血清培养基1∶4 稀释，在Transwell小室上层均匀铺100 μl稀释过的Matrigel，放入37 ℃培养箱中，孵育1-2 h至Matrigel呈固态;③将指数生长期的MCF7/ADR细胞种于六孔板中，过夜后，细胞满度达到30%左右。然后分别转染特异的ATP6L的干扰片段及对照干扰片段。转染36 h后消化细胞，用无血清培养液洗后重悬，对细胞进行计数，用1640培养液调整细胞数为105个/300 μl。④用无血清培养液1640洗 Matrigel 1 次;在上室每孔中加入300 μl的细胞悬液; ⑤在下腔室中加入1 ml含有10%FBS 的1640培养液;⑥37 ℃、5%CO2条件下培养48 h后取出Transwell小室，用PBS 洗2 遍，用镊子夹住棉球擦去小室表面的细胞，然后用4%低聚甲醛于室温固定15 min; ⑦用结晶紫(0.1%)染色10 min后，PBS洗2遍，显微镜下(×200)直接观察穿过膜的细胞数。随机计数5个不同视野中(上、下、左、右、中)穿过8.0 μm微孔的细胞数，取平均值，实验重复3次。

　　1.9 统计学分析

　　数据分析用SPSS11.5软件，用± s表示。两组数据用双侧t检验;多组数据用单因素方差分析。P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 细胞泌H+能力

　　为了排除干扰片段的脱靶效应对实验的影响，以上实验均是同时用siRNA2ATP6L及siRNA3ATP6L干扰片段进行的，而且取得的结果一致。VATPase质子泵可以通过水解ATP供能，把H+泵出细胞外，使细胞外呈酸性。用特异的靶向ATP6L的干扰片段转染MCF7/ADR细胞，48 h后换成不添加碳酸氢钠的1640培养液，以排除依赖HCO3-/H+转运泵对实验的干扰。测定12 h后收集的细胞上清pH，计算得到相应的氢离子浓度。实验结果表明，ATP6L的表达下调导致MCF7/ADR细胞泌H+减少(图1)。

　　2.2 实时定量PCR测定细胞中MMP2的表达

　　用特异的靶向ATP6L的干扰片段转染MCF7/ADR细胞，48 h后抽提细胞总RNA并逆转录。用MMP2的特异引物扩增，定量PCR仪检测MMP2的Ct值。结果发现，用β肌动蛋白作为内参矫正后，siRNAATP6L组细胞的MMP2表达量与对照组及干扰对照细胞相比差异无统计学意义(图2)。

　　2.3 细胞分泌上清中MMP2的活性

　　用特异的靶向ATP6L的干扰片段转染MCF7/ADR细胞，48 h后换成1640无血清培养液。24 h后收集的细胞上清行明胶酶谱实验。细胞上清中的MMP2被激活后可以降解明胶，被分解后的凝胶比较透亮。图3的结果表明，siRNAATP6L组细胞中激活形式的MMP2分解明胶的能力较对照组细胞显著下降(P&<0.05)。

　　2.4 细胞体外侵袭能力

　　用特异的靶向ATP6L的干扰片段转染MCF7/ADR细胞，36 h后消化细胞成细胞悬液。然后种细胞于铺有Matrigel的Transwell小室，48 h后计数穿过膜的细胞数。如图4，图5所示，MCF7/ADR细胞在ATP6L表达下调后，穿过Transwell小室的细胞数显著降低(P&<0.05)。

　　3 讨 论

　　MCF7/ADR乳腺癌耐药细胞有P糖蛋白(Pglycoprotein， Pgp)的表达。Pgp是由MDR1基因编码的相对分子质量170 000的跨膜糖蛋白，属于ATP结合盒(ATPbinding cassette， ABC)膜转运蛋白超家族成员。肿瘤存在的缺氧微环境能诱导其表达增加。Pgp能通过消耗ATP将多种药物泵出细胞外，使细胞内药物聚积减少，从而减弱药物的细胞毒作用，使细胞产生耐药性。Pgp除了与细胞的耐药性有关外，据文献报道，CD44受体可以与Pgp相互作用，促进乳腺癌及黑色素瘤细胞的侵袭及迁移[11，12]。对黑色素瘤M14细胞转染MDR1基因可增强细胞的侵袭性，干扰MDR1基因的表达可以抑制细胞的侵袭及迁移。MCF7/ADR乳腺癌耐药细胞与MCF7乳腺癌细胞相比不但对化疗药物产生耐药而且其转移能力增强，因而如何同时克服耐药及复发转移在乳腺癌治疗中相当重要。

　　VATPase作为一类酶，在真核细胞中广泛存在。在肿瘤细胞中，VATPase不仅定位在细胞器膜，还定位在细胞质膜上。有报道称，在耐药细胞中，VATPase表达增强[13]。靶向ATP6L(VATPase跨膜V0结构域中的c亚单位)的RNA干扰可以增敏化疗药物在MCF7/ADR细胞中发挥抗肿瘤作用，而且这种增敏作用不依赖于化疗药物的细胞内靶点以及导致肿瘤耐药的机制[9]。质子泵在转移性强的乳腺癌细胞中表达强，而在转移性弱的细胞中表达弱[5]，提示质子泵与乳腺癌的转移相关。我们实验室先前的实验结果表明，ATP6L的表达被抑制的高转移肝癌M3细胞体内外侵袭能力下降[14，15]。

　　VATPases 的作用影响到降解细胞外基质(extracellular matrix， ECM)的许多蛋白酶的激活、分泌和细胞分布[16，17]。如降解和重构ECM的重要蛋白酶类——基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)的激活需要一个细胞外低pH环境。Ⅳ型胶原参与构成上皮细胞基膜和血管、淋巴管的管壁基质。MMP2/MMP9的作用底物是Ⅳ型胶原。MMP2和MMP9都以没有活性的酶原形式存在，当细胞外微环境发生酸化时，MMP2和MMP9被激活为活性形式而发挥作用。因而MMP2/MMP9的活性对于肿瘤细胞突破基质屏障及浸润转移至关重要。肿瘤细胞VATPase c亚基即ATP6L的过表达可促进肿瘤细胞MMP2的分泌与激活，肿瘤细胞的侵袭力也增强[18]。用质子泵的特异抑制剂Bafilomycin A1作用后，细胞的MMP降解基质的能力降低[19]。VATPase除了通过调节pH的机制影响MMP2/MMP9的活性外，还有其他机制如影响细胞的黏附及迁移。ATP6L与整合素(integrin)直接作用影响整合素在膜系统上的循环及在细胞膜上分布的浓度以致改变细胞的黏附性[20]。VATPase的C亚基还通过与肌动蛋白锚定而与细胞骨架相连[21]，VATPase的B亚基氨基端也有与肌动蛋白的结合点[22]。这样，VATPase可通过与细胞骨架相互作用从而影响细胞的迁徙过程。

　　本研究旨在探讨靶向ATP6L的RNA干扰是否可以抑制肿瘤MCF7/ADR细胞的侵袭转移。实验用化学合成的ATP6L的干扰片段转染MCF7/ADR细胞，然后观察细胞的体外侵袭能力。结果表明ATP6L的表达下调可使细胞向胞外泵运H+的能力下调(图1)，对H+敏感的MMP2的活性下降(图3)，MCF7/ADR细胞体外侵袭能力受抑制(图4，5)。

　　我们采用RNA干扰沉默ATP6L的策略，可增敏化疗药物对乳腺癌耐药细胞株的作用，并同时抑制肿瘤耐药细胞侵袭和转移。因此，RNA干扰ATP6L基因与化疗药物联用，可望成为肿瘤治疗的有效手段。

参考文献

　　[1] Freedman GM，Fowble BL. Local recurrence after mastectomy or breastconserving surgery and radiation [J]. Oncology， 2000，14(11):1561-1581.

　　[2] Schuck A， Konemann S， Matthees B， et al. Radiotherapy in the treatment for treating locoregional relapses of breast cancer[J]. Br J Radiol， 2002，75(896):663-669.

　　[3] 刘凌晓，王小林，颜志平，等.乳腺癌肝转移的介入治疗[J].中国临床医学， 2007，14(5):649-651.

　　[4] 梁后杰，邹 岚. 复发转移性乳腺癌内科治疗原则[J].中华乳腺病杂志，2007，1(4):74-77.

　　[5] Sennoune SR， Bakunts K， Martínez GM， et al. Vacuolar H+ATPase in human breast cancer cells with distinct metastatic potential: distribution and functional activity [J]. Am J Physiol Cell Physiol， 2004， 286(6): C1443-1452.

　　[6] Gatenby RA， Gawlinski ET. The glycolytic phenotype in carcinogenesis and tumor invasion: insights through mathematical models [J]. Cancer Res， 2003， 63(14):3847-3854.

　　[7] Cipriano DJ， Wang Y， Bond S， et al. Structure and regulation of the vacuolar ATPases [J]. Biochim Biophys Acta， 2008， 1777(7/8):599-604.

　　[8] 游海燕，邓 云，覃文新. VATPases抑制剂在人类疾病中的应用[J].生命科学，2009，21(4):499-503.

　　[9] You H， Jin J， Shu H， et al. Small interfering RNA targeting the subunit ATP6L of proton pump VATPase overcomes chemoresistance of breast cancer cells [J]. Cancer Lett， 2009，280(1):110-119.

　　[10] Chaillet JR， Amsler K， Boron WF， et al. Optical measurements of intracellular pH in single LLCPRI cells: demonstration of Cl/HCO3exchange [J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1986， 83(2): 522-528.

　　[11] MilettiGonzlez KE， Chen S， Muthukumaran N， et al. The CD44 receptor interacts with Pglycoprotein to promote cell migration and invasion in cancer[J]. Cancer Res， 2005， 65(15): 6660-6667.

　　[12] Colone M， Calcabrini A， Toccacieli L， et al. The multidrug transporter Pglycoprotein: a mediator of melanoma invasion[J]. J Invest Dermatol， 2008， 128(4):957-971.

　　[13] Murakami T， Shibuya I， Ise T， et al. Elevated expression of vacuolar proton pump genes and cellular pH in cisplatin resistance[J]. Int J Cancer， 2001， 93(6):869-874.

　　[14] Lu X， Qin W， Li J， et al. The growth and metastasis of human hepatocellular carcinoma xenografts are inhibited by small interfering RNA targeting to the subunit ATP6L of proton pump[J]. Cancer Res， 2005， 65(15):6843-6849.

　　[15] Fais S， De Milito A， You H， et al. Targeting vacuolar H+ATPases as a new strategy against cancer [J]. Cancer Res， 2007，67(22):10627-10630.

　　[16] Raghunand N， Gatenby RA， Gilies RJ， et al， Microenvironmental and cellular consequences of altered blood flow in tumours[J]. Br J Radiol， 2003， 76(1): 11-22.

　　[17] Rofstad EK， Mathiesen B， Kindem K， et al. Acidic extracellular pH promotes experimental metastasis of human melanoma cells in athymic nude mice[J]. Cancer Res， 2006， 66(13): 6699-6707.

　　[18] Kubota S， Seyama Y. Overexpression of vacuolar ATPase 16kDa subunit in 10T1/2 fibroblasts enhances invasion with concomitant induction of matrix metalloproteinase2[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 278(2):390-394.

　　[19] Creemers LB， Jansen ID， Hoeben KA， et al. Involvement of VATPases in the digestion of soft connective tissue collagen[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1998， 251(2): 429-436.

　　[20] Lee I， Skinner MA， Guo HB， et al. Expression of the vacuolar H+ATPase 16kDa subunit results in the Triton X100insoluble aggregation of beta1 integrin and reduction of its cell surface expression[J]. J Biol Chem， 2004， 279(51): 53007-53014.

　　[21] Vitavska O， Wieczorek H， Merzendorfer H， et al. A novel role for subunit c in mediating binding of the H+VATPase to the actin cytoskeleton[J]. J Biol Chem， 2003， 278(20):18499-18505.

　　[22] Holliday LS， Lu M， Lee BS， et al. The aminoterminal domain of the B subunit of vacuolar H+ATPase contains a filamentous actin binding site[J]. J Biol Chem， 2000， 275(41):32331-32337.