cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ对胃癌细胞BGC823迁移的影响

　　　　 作者：任峰， 高倩， 陶燕， 桑建荣， 杨小明， 范少华， 陈永昌

【摘要】 目的： 研究cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(cGMP dependent protein kinase Ⅱ，PKG Ⅱ)对胃癌细胞株BGC823迁移活动的影响，并对其作用机制进行初步探讨。方法： 以携带PKG Ⅱ基因的腺病毒结构AdPKG Ⅱ感染胃癌BGC823细胞，用蛋白质印迹法及免疫荧光检测感染病毒后PKG Ⅱ的表达。用特异性PKG Ⅱ激活剂8pCPTcGMP作用感染病毒的细胞，通过Boyden 槽迁移率、刮除迁移分析法分析PKG Ⅱ高表达和活性增高对Ras同源性蛋白A(Ras homolog A， RhoA)激动剂溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)诱导的胃癌细胞迁移的影响。结果： 胃癌细胞株BGC823 在感染AdPKG Ⅱ后高表达PKG Ⅱ，经cGMP类似物8pCPTcGMP 激活后，使RhoA活化诱导的细胞迁移活动受到明显抑制，与对照组比较差异有统计学意义(P&<0.05)。结论： PKG Ⅱ能明显抑制胃癌细胞株BGC823的迁移。

【关键词】 cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ; 胃癌细胞; 细胞迁移

　　[Abstract] Objective: To investigate the effect of cGMP dependent protein kinase Ⅱ on the gastric cancer cell migration. Methods： An adenovirus encoding PKG Ⅱ gene was used to infect BGC823 cells.PKG Ⅱ expressions were detected with Western blotting and immunofluorescence microscopy. The cells were treated with cGMP analogues 8pCPTcGMP to activate PKG Ⅱ and the effect on Ras homolog A (RhoA) agonist lysophosphatidic acid (LPA) induced cell migration was examined by Boyden scrapemigration assay and chamber migration assay. Results： The PKG Ⅱ expression in gastric cancer cell BGC823 was increased after AdPKG Ⅱ infection. When the cells were treated with 8pCPTcGMP， there was a significant inhibition on LPA induced cell migration(P&<0.05， compared with control group). Conclusion： The results indicate that activation of PKG Ⅱ can inhibit migration of human gastric cancer cells.

　　[Key words] cGMP dependent protein kinase Ⅱ; gastric cancer cells; cell migration

　　cGMP依赖性蛋白激酶(cGMP dependent protein kinase G，PKG)是广泛存在于真核细胞内的一类丝/苏氨酸蛋白激酶。现有的研究表明，PKG Ⅰ在某些肿瘤组织中的表达水平比正常组织明显降低，将外源PKG Ⅰ DNA转染细胞，则可抑制裸鼠模型中肿瘤细胞的生长和侵袭[1];PKG Ⅰ也有助于细胞的黏附链接，增加细胞的接触抑制，抑制血管的再生和肿瘤的生长[2，3]。这表明PKG Ⅰ具有一定的抗肿瘤作用[4]，是一种新的肿瘤抑制因子[5]。对于PKG Ⅱ，已有资料显示其对细胞的增殖具有抑制作用[6]，而我们最近又发现PKG Ⅱ在胃癌细胞中的表达明显降低[7]，并且对胃癌细胞的增殖活动具有明显的抑制作用[8]。但是，PKG Ⅱ是否对胃癌细胞的迁移活动同样具有抑制作用，还未见明确报道。本研究旨在利用腺病毒表达载体，将PKG Ⅱ基因导入胃癌细胞，使其高表达，并以特异性PKG Ⅱ激活剂8pCPTcGMP作用感染细胞，激活PKG Ⅱ，观察活化的PKG Ⅱ对胃癌细胞迁移活动的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　人胃癌细胞BGC823由上海细胞生物研究所提供;小牛血清购自兰州民海生物公司;DMEM购自 Gibco公司;PKGⅡ抗体购自Abgent公司;羊抗兔 IgG多克隆抗体购自中杉公司;8pCPTcGMP 购自 Calbiochem公司;Boyden迁移槽购自Costar公司;ECL购自Amersham Biosciences公司;携带LacZ和PKG Ⅱ基因的腺病毒载体由本实验室构建。其他试剂均为国产或进口分析纯。

　　1.2 细胞培养

　　人胃癌细胞株BGC823用含10%小牛血清的DMEM，置于37 ℃、5%CO2的孵育箱中培养。待细胞铺满瓶底后，用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合消化液消化，传代培养。感染病毒前一天接种细胞，细胞密度调整为70%。

　　1.3 蛋白质印迹法检测PKG Ⅱ表达

　　将胃癌细胞BGC823接种到6孔板中，细胞密度为5×105/孔。携带PKG Ⅱ基因的重组腺病毒(AdPKG Ⅱ)分别按感染复数(multiplicity of infection，MOI)为0，50，100感染胃癌细胞BGC823。培养24 h后，提取感染病毒细胞的总蛋白，以10% SDSPAGE电泳分离，4 ℃，90 mA恒流转膜过夜。结束后，取出PVDF膜在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h。将膜以适量的一抗稀释液(兔抗人PKG Ⅱ单抗按1∶200稀释，山羊抗人GAPDH单抗按1∶1 000稀释)室温下摇床孵育2 h，以HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000)稀释液，同条件孵育1 h，每次孵育后以TBST漂洗3次。用ECL发光剂显示阳性条带，在Typhoon分子成像系统上记录结果。

　　1.4 免疫荧光观察

　　AdPKG Ⅱ按MOI为100感染胃癌细胞BGC823。感染病毒后的细胞接种于24孔细胞培养板中的盖玻片上，密度为 30%左右，24 h后，细胞用新配的4%低聚甲醛4 ℃固定过夜，PBS洗3遍;用 0.3%的 TritonX100作用 8 min以使细胞膜通透性增加;3%BSA室温孵育1 h以封闭非特异结合位点;一抗孵育为4 ℃过夜，二抗孵育为室温1 h， 细胞再以Hoechst 33342(0.2 μmol/L)于37 ℃作用10 min进行核染色;每一步后均用 PBS洗3遍。用甘油固定后于荧光显微镜下观察结果。

　　1.5 Boyden槽迁移率分析

　　选用直径为60 mm、膜孔径为8 μm的Boyden迁移槽。MOI为100的AdPKG Ⅱ或携带LacZ基因的重组腺病毒(表达β半乳糖酶的对照载体AdLacZ)感染胃癌细胞BGC823后，经胰酶消化，离心收集并计数。每个迁移槽中加入0.5 ml含有 10%小牛血清的DMEM和1×105个细胞。分组为:对照组(LacZ组);溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)组(LacZ+LPA组)，LPA为RhoA的激动剂，可以激活RhoA进而促进细胞迁移作用;单纯PKG Ⅱ高表达组(PKG Ⅱ+LPA组);250 μmol/L 8pCPTcGMP激活PKG Ⅱ组(PKG Ⅱ+8pCPTcGMP+LPA组)。加入LPA和(或)8pCPTcGMP，加药后孵育12 h。将迁移槽取出，用棉花棒将迁移槽中未迁移的细胞擦净。50%甲醇+10%乙醇固定膜45 s，PBS洗膜1 min，再用甲苯胺蓝染色30 s，然后用70%乙醇脱色，100%乙醇脱水30 s，最后将膜在水中漂洗数次，各组显微镜下随机计数10个400倍视野中的细胞。

　　1.6 刮除迁移分析法

　　在24孔细胞培养板背面，每孔划两条相距5 mm 的直线。按MOI为100的AdPKG Ⅱ感染胃癌细胞BGC823后，经胰酶消化并计数，每孔接种5×104个细胞。24 h后，用消毒的细胞刮子将两划线区域内的细胞刮干净，再分别加入LPA和(或)250 μmol/L 8pCPTcGMP，继续培养48 h，期间不更换培养液，不同时间后在倒置显微镜下观察记录细胞迁移情况。

　　1.7 统计学处理

　　所有实验数据用SPSS11.5软件分析，实验结果是3次独立实验的平均值，平均值在α为5%的水平上进行方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 胃癌细胞中PKG Ⅱ蛋白的表达

　　蛋白质印迹测定结果显示，未感染组PKG Ⅱ几乎未表达，而感染AdPKG Ⅱ可使细胞的PKG Ⅱ表达明显增加，在一定范围内呈浓度依赖性(图1a)。免疫荧光结果亦验证感染后的高表达(图1b)。这为研究高表达的PKG Ⅱ在胃癌细胞中的作用提供了实验基础。

　　a:蛋白质印迹显示不同感染复数的病毒感染胃癌细胞后PKG Ⅱ的表达;b:免疫荧光检测PKG Ⅱ在未感染与感染腺病毒细胞中的表达

　　2.2 Boyden槽检测PKG Ⅱ对细胞迁移的影响

　　Boyden 槽迁移率分析法结果显示，孵育12 h后，可见细胞经过膜上的小孔，迁移到膜的底侧，经甲苯胺蓝染色后，细胞呈淡蓝色，清晰可见 (图2a)。LacZ组，迁移细胞数为每10个高倍视野(185±5)个，LacZ+LPA组可使细胞迁移活动明显加强，迁移细胞数达每10个高倍视野(486±11)个，PKG Ⅱ+LPA组并不能抑制由LPA引起的迁移，而PKG Ⅱ+8pCPTcGMP+LPA组细胞迁移数与LacZ+LPA、PKG Ⅱ+LPA组相比明显减少，P&<0.05 (图 2b)。

　　2.3 刮除迁移分析法检测PKG Ⅱ对细胞迁移的作用 为进一步验证上述结果，我们采用刮除迁移分析法进行了实验。结果显示，刮除后24 h，未刮除部分的细胞可迁移进入刮除的区域。加入 LPA后，相同时间内发生迁移的细胞数比对照组明显增多。预先加入8pCPTcGMP，可以有效地阻断 LPA 的作用，说明活化的PKG Ⅱ可以有效地抑制细胞的迁移活性(图3)。

　　a:两线间细胞被刮干净，之间无细胞;b:未加LPA的AdLacZ对照组，有少量细胞越过界限;c， d:在感染AdLacZ、AdPKG Ⅱ组加入LPA后细胞迁移明显增多; e:在感染AdPKG Ⅱ组先加入8pCPTcGMP再加入LPA，细胞迁移受到明显抑制

　　3 讨 论

　　肿瘤细胞的侵袭与转移是恶性肿瘤的基本特征之一，尤其是在肿瘤发展的最后阶段，控制转移是决定患者预后的关键因素[9]。目前认为恶性肿瘤的侵袭能力在其恶性转化的早期即可获得，部分肿瘤随着病情进展，其侵袭能力还有逐渐增强的趋势，增加了恶性肿瘤的增殖和转移能力。如何阻断癌细胞的侵袭与转移、实现带瘤生存是目前肿瘤治疗研究的热点之一。

　　由于PKG Ⅱ在癌细胞的表达降低，人为升高其表达使其活性增高，是有效研究其作用的方法。为此，我们利用编码PKG Ⅱ基因的重组腺病毒载体，感染胃癌细胞株，进行有关实验。预实验结果表明，在筛选的胃癌细胞株中，BGC823对腺病毒最为敏感。AdLacZ感染后检测β半乳糖酶表达，结果显示受感染细胞达90%以上。而AdPKG Ⅱ感染后，用蛋白质印迹和免疫荧光均证实感染可使胃癌BGC823细胞高表达PKG Ⅱ。这一细胞株的高恶性程度以及对腺病毒的高敏感性，为研究PKG Ⅱ对细胞恶性程度的逆转作用提供了理想的研究对象。

　　小G蛋白RhoA在癌细胞迁移过程中有重要作用，当RhoA活性改变时，癌细胞侵入性生长和迁移都受到影响[10]。有资料表明，PKG Ⅱ可以使RhoA188位丝氨酸磷酸化并抑制RhoA活性[11-13]，而RhoA可以促进癌细胞的迁移。因此，我们设想，PKG Ⅱ对胃癌细胞迁移活动也有抑制作用。本实验利用RhoA激动剂溶血磷脂酸作用细胞，促进癌细胞的迁移，在此基础上观察PKG Ⅱ对BGC823细胞迁移活动的影响。结果表明，以AdPKG Ⅱ感染细胞，使其高表达PKG Ⅱ，再以cGMP类似物8pCPTcGMP激活PKG Ⅱ，可以明显抑制溶血磷脂酸引起的细胞迁移。另外，相对于AdLacZ组，单纯AdPKG Ⅱ感染组细胞迁移只是略有降低，这表明单纯PKG Ⅱ的高表达，还不能抑制癌细胞的迁移，只有在PKG Ⅱ被激活后，才能发挥对细胞迁移的抑制作用。

　　我们的研究表明，PKG Ⅱ与胃癌细胞的迁移活动密切相关，是一个潜在的抑癌因子。在后续的工作中，我们将对与此有关的信号转导过程进行深入的探讨。弄清这些问题，将有利于进一步认识胃癌细胞的发生发展机制，为胃癌的治疗提供新的思路。

参考文献

　[1] Hou Y， Gupta N， Schoenlein P， et al. An antitumor role for cGMPdependent protein kinase[J]. Cancer Lett， 2006， 240(1):60-68.

　　[2] Browing DD. Protein kinase G as a therapeutic target for the treatment of metastatic colorectal cancer[J]. Expert Opin Ther Targets， 2008， 12(3): 367-376.

　　[3] Moldobaeva A，WelshServinsky LE， Shimoda LA， et al. Role of protein kinase G in barrierprotective effects of cGMP in human pulmonary artery endothelial cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol， 2006， 290 (5): L919-L930.

　　[4] 王晓华，童 梅，窦 豆，等. 环鸟苷酸依赖的蛋白激酶对心血管功能的调节作用[J]. 生理学科学进展，2005，36 (4):299-303.

　　[5] Cohen MV，Downey JM. Cardioprotection: spotlight on PKG[J]. Br J Pharmacol， 2007， 152 (6): 833-834.

　　[6] Cook AM， Haynes JM. Protein kinase G Ⅱmediated proliferative effects in human cultured prostatic stromal cells[J]. Cell Signal， 2004， 16 (2): 253-261.

　　[7] 杨树芹，陈永昌，王 瑛， 等. cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ在癌细胞株中的表达及活性[J]. 江苏大学学报: 医学版， 2008，18 (1):1-5.

　　[8] Chen YC， Ren F， Sang JR， et al. Type Ⅱ cGMPdependent protein kinase inhibits proliferation of the gastric cancer cell line BGC823[J]. Mol Med Report， 2010， 3 (2): 361-366.

　　[9] Matsuoka H， Tsubaki M， Yamazoe Y，et al. Tamoxifen inhibits tumor cell invasion and metastasis in mouse melanoma through suppression of PKC/MEK/ERK and PKC/PI3K/Akt pathways[J]. Exp Cell Res， 2009， 315 (12): 2022-2032.

　　[10] Sahai E， Marshall CJ. RHOGRPases and cancer[J]. Nat Rev Cancer， 2002， 2 (2):133-142.

　　[11] Zhang H， Wang D， Sun H， et al. MAGI3 regulates LPAinduced activation of Erk and RhoA[J]. Cell Signal， 2007， 19 (2): 261-268.

　　[12] RolliDerkinderen M， Sauzeau V， Boyer L，et al. Phosphorylation of serine 188 Protects RhoA from ubiquitin/proteasomemediated degradation in vascular smooth muscle cells[J]. Circ Res， 2005， 96 (11):1152-1160.

　　[13] Gudi T， Chen JC， Casteel DE， et al. cGMPdependent protein kinase inhibits serumresponse elementdependent transcription by inhibiting rho activation and functions[J]. J Biol Chem， 2002， 277 (40): 37382-37393.