幽门螺杆菌外膜蛋白cagL基因的克隆、表达及其对IL8 mRNA表达的影响

　　　　 作者：黄世腾，邵世和，韩军，黄河，田树伟

【摘要】 　　目的： 克隆表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori， H.pylori）NCTC11637菌株cagL基因，并探讨其对IL8 mRNA表达的影响。方法： 设计cagL引物，应用PCR扩增目的基因片段，TA克隆后测序分析， 用信息学软件分析其物理化学特性，并构建表达载体cagLPET28a(+)转化E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达， 镍亲和层析纯化，SDS PAGE及 蛋白质印迹鉴定表达蛋白。纯化蛋白与细胞GES1共培养，提取细胞总RNA，RTPCR检测细胞IL8mRNA表达。结果： 测序分析表明cagL编码成熟肽的碱基序列为654 bp，编码217个氨基酸，与基因库公布的其他H.pylori菌株的基因序列同源性为96%～98%，氨基酸同源性为 97%～99%，软件预测显示有多个明显的具有抗原活性的结构域；表达蛋白的相对分子质量约为32 000，蛋白质印迹检测融合蛋白具有良好的抗原活性；重组蛋白作用于GES1细胞后，可诱导细胞因子 IL8 在 mRNA 水平上的表达。结论: CagL蛋白可刺激GES1细胞IL8 mRNA的表达。

【关键词】 幽门螺杆菌； 原核表达； 白细胞介素8

　　［Abstract］Objective: To detect the influence of the CagL protein from H.pylori strain NCTC11637 on interleukin8 mRNA expressing. Methods： Polymerase chain reaction(PCR) was used to amplify the cagL gene from H.pylori strain NCTC11637 chromosomal DNA. Then the target gene was analyzed and inserted into the prokaryotic expression vector PET28a(+).The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21(DE3).The transformant colony was induced with IPTG and the fusion protein was analyzed by SDSPAGE and Western blot. The purified CagL was coincubated with GES1 cells， RTPCR was performed to study the mRNA expression level of IL8. Results: The recombinant plasmid was constructed. DNA sequence analysis showed the sequence of cagL encoding mature peptide was 654 bp. The homology of the strains in nucleotide acid was 96%～98%. Their homogeneity in the amino acids was 97%～99%. The software predicted the fusion protein possessed good antigencity. Its relative molecular mass was about 32 000. Western blot method showed good antigenicity of the fusion protein. It can stimulate GES1 cells to express IL8 mRNA.Conclusion: The CagL recombinant protein can induce GES1 cells to express IL8 mRNA，which provides a foundation for the further studies on its biological function.

　　［Key words］Helicobacter pylori； prokaryotic expression； interleukin8

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori， H.pylori)的致病机制极其复杂，致使其引发的相关疾病，如胃炎、十二指肠溃疡、胃腺癌和胃黏膜相关性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤的分子机制尚不十分清楚。文献报道，其主要毒力因子CagA是通过cag致病岛（pathogenicity island， cag PAI）编码的Ⅳ型分泌系统（type Ⅳ secretion system， TFSS）转运至宿主细胞内［1］，从而引起相关疾病的发生，但对于其转运机制以及H.pylori如何影响宿主细胞膜动力学还不清楚。CagL就是由cag致病岛编码并存在于Ⅳ型分泌系统纤毛上的一种蛋白，能够通过与宿主细胞膜上的整合素（integrins）相互作用，从而发挥其生物学功能［2，3］。本研究克隆表达了cagL基因，并初步探讨了其重组蛋白对IL8 表达的影响，为进一步研究H.pylori的致病机制奠定了基础。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株及质粒

　　H.pylori NCTC11637购自中国预防科学院流行病学研究所；大肠埃希菌 DH5α，BL21（DE3），PET28a(+)载体由江苏大学基础医学与医学技术学院中心实验室保存；pGEMT载体购自 Promega公司。

　　1.1.2 主要试剂和仪器

　　T4DNA连接酶、限制性内切酶、dNTP、高保真DNA Taq聚合酶，IPTG，DNA标准参照物及蛋白质分子量标准均购自TaKaRa公司，蛋白纯化试剂盒购自Qiagen公司；His单抗、HRP标记的羊抗鼠/兔IgG购自华美生物公司; ECL 化学反光试剂盒购自GE公司;PVDF膜购自Millipore公司;哥伦比亚培养基、厌氧袋购自Oxoid公司;LPS购自 TaKaRa公司；RNA 提取试剂盒购自Fastegen公司；ReverTra AceαTMRT PCR Kit购自Toyobo公司；CagA蛋白抗体购自Santa Cruz公司；β肌动蛋白内参抗体购自武汉博士德公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；其他试剂均为国产分析纯。核酸紫外检测仪(Eppendorf Biophotometer)；PC仪(Eppendorf)；凝胶成像系统(GeNius)。
　　
　　1.2 方法

　　1.2.1 H.pylori的培养与鉴定及基因组DNA提取

　　H.pylori NCTC11637 标准菌株按常规微需氧方法培养。 DNA用常规酚、 氯仿抽提法获得，用分光光度计测定DNA浓度及纯度，-20℃保存备用，具体步骤参照分子克隆Ⅲ。

　　1.2.2 目的基因的扩增

　　根据基因库中已报道的H.pylori 26695 NC_000915的cagL基因（Hp0539基因）序列，利用软件Primer Premier5.0设计PCR引物，上游引物：　　　　 5′GATGGATCCGAAGATATAACAAGCGGTTT3′（29 bp），下游引物：5′ GCCCTCGAGTTTAACAATGATCTTACTTGA3′(30 bp)，在上下游引物中分别引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点，引物由上海生工生物工程公司合成。以提取的H.pylori基因组 DNA为模板，用Taq DNA聚合酶按照普通 PCR条件进行扩增（50 μl反应体系)。扩增参数为94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环，72℃ 10 min；PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，GeNius凝胶电泳图像分析系统分析鉴定并用胶回收试剂盒回收 PCR 产物。

　　1.2.3 TA克隆和测序

　　将胶回收纯化的 PCR产物 TA克隆入载体 pGEMT， 4℃连接过夜，以连接产物(cagLpGEMT)转化感受态 E.coli DH5α，进行蓝白斑筛选随机挑取白色菌落， 37℃， 250 r/min摇过夜菌，碱裂解法提取质粒，进行酶切鉴定，将阳性重组质粒委托上海生工生物公司测序，将该目的基因的 DNA 序列与已经发表的H.pylori株26695，J99及 ATCC43504等相应序列进行比对。

　　1.2.4 序列分析

　　用生物信息分析软件 Omiga 2.0，Antheprot v5.0和 Swissport数据库对cagL基因及其编码的氨基酸序列进行同源性分析，并对相应蛋白质分子的主要化学特征和抗原结构域进行预测。

　　1.2.5 重组表达质粒的构建及鉴定

　　将TA克隆鉴定阳性的质粒和PET28a(+)表达质粒分别经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后，回收酶切片段，将回收的目的基因和表达质粒按3∶1（摩尔数）用T4连接酶16℃连接过夜，反应体积为10 μl，连接产物转化感受态细菌 E.coli BL21(DE3)，双酶切鉴定筛选出阳性克隆。

　　1.2.6 融合蛋白的表达

　　将鉴定为阳性的重组工程菌接种于3 ml LB培养基中（含50 mg/L卡那霉素），37℃振荡培养过夜，取上述培养物按 1∶50体积接种于新鲜 LB培养基（含50 mg/L卡那霉素），37℃振荡培养至D(600 nm)为0.5～0.6时，加 IPTG 至终浓度为1 mmol/L，30℃继续培养，收集诱导2～5 h的菌液，采用 SDSPAGE分析融合蛋白的表达， 并以空载体PET28a(+)转化菌E.coli BL21(DE3)诱导后为阴性对照，用凝胶成像系统分析重组蛋白的相对含量。

　　1.2.7 融合蛋白的纯化及蛋白质印迹分析

　　收集优化条件后的诱导菌，分别对破碎上清及沉淀进行SDSPAGE电泳，分析重组表达产物的表达形式。扩大诱导培养，诱导4 h后5 000 r/min离心收集菌体，菌液用 PBS洗2遍后，超声破碎菌液，离心得到的蛋白包涵体用变性裂解缓冲液重悬，最后用 Ni NTA柱纯化CagL重组蛋白，收集洗脱液，进行SDS PAGE分析；纯化的蛋白物经10%的SDSPAGE 电泳，取下凝胶进行转印，电转移至硝酸纤维膜上，分别以鼠抗His标签单克隆抗体为一抗，山羊抗鼠IgGHRP为二抗，TBST洗膜后，按 ECL 化学发光试剂盒说明书进行X光片曝光。

　　1.2.8 细胞因子IL8的检测

　　GES1细胞于DMEM中常规培养2～3 d，致使细胞融合度达到80%～90%，加入可溶性目的蛋白至终浓度分别为1，5，10，15，20，30 μg/ml，共培养4 h，用LPS做阳性对照，以PET28a(+)空质粒转化的宿主菌的平行提取物为阴性对照，按RNA提取试剂盒的步骤提取细胞总RNA，检测RNA的浓度；并反转录为cDNA，以此为模板进行常规PCR。IL8引物P1:5′TACTCCAAACCTTTCCACCC3′(20 bp)；P2： 5′CCTACAACAGACCCACACAAT3′(21 bp)；磷酸甘油醛脱氢酶(GADPH， 内参)引物参照文献［4］；PCR扩增参数:94℃ 5 min，94℃ 30 s，59℃ 45 s，72℃ 45 s；30个循环；72℃ 10 min。PCR产物用1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 H.pylori的分离培养与鉴定
　　
　　培养96 h的NCTC11637 经革兰染色后，光镜下可见海鸥状、弧形、S形的革兰阴性菌，尿素酶、氧化酶、触酶试验均阳性。
　　
　　2.2 cagL基因PCR扩增结果　　
　　
　　琼脂糖凝胶电泳分析显示，PCR扩增的目的 DNA片段大小同预期的结果相符，无非特异性条带，见图1。

　　2.3 重组质粒的酶切鉴定
　　
　　将 PCR 产物与pGEMＴ载体连接产物转化至DH5α，随机挑取菌落，抽提质粒，经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后电泳，阳性克隆出现两条带分别位于约3 003 bp和654 bp处(图2)，同预期的结果相符，回收经BamHⅠ及XhoⅠ双酶切切下的目的小片段，连接到表达载体PET28a(+)上，经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后电泳，阳性克隆出现两条带分别位于约5 369 bp和654 bp处(图3)，大小与预计相符。

　　2.4 CagL的化学特征分析及抗原性预测
　　
　　对cagLpGEMT序列的测定显示该基因高度保守，与基因库中公布的其他菌株(26695，J99，ATCC43504)的核酸序列相比较，同源性为96%～98%，氨基酸同源性为97%～ 99%，表明cagL基因序列较为保守可作为候选疫苗研究；利用Omiga 2.0和Antheprot V5.0软件分析显示CagL蛋白含217个氨基酸，相对分子质量为24 620，等电点为5.31，抗原性预测显示该蛋白有多个明显的具有抗原活性的结构域（图4）。

　　2.5 重组蛋白在E.coil中的表达
　　
　　将重组表达质粒的转化菌经IPTG诱导后，显示约32 000处出现一条蛋白带，与理论推算大小基本一致，阴性对照组未出现相应的蛋白带，条带扫描分析融合蛋白的表达量最高可达总蛋白的48%，优化表达条件后，用1 mmol/L IPTG于30℃诱导培养，分别于2，3，4，5 h采样，电泳后进行条带扫描分析，各时间段的蛋白表达见图5，可见诱导4 h后，融合蛋白的表达量最高。

　　2.6 重组蛋白的纯化及蛋白质印迹鉴定
　　
　　诱导后重组菌经超声破碎后分别取上清和沉淀进行SDSPAGE电泳，结果发现表达产物主要存在于包涵体中，经过NiNTA 琼脂糖亲和层析过柱后，用洗脱液洗脱后进行SDSPAGE电泳，可见胶上呈现单一条带，计算机灰度扫描纯度达95%以上。表达产物用鼠抗Histag抗体和HRP标记的羊抗兔二抗进行蛋白质印迹分析显示，重组子在相对分子质量约32 000处可见一特异性条带， 同时以空载体菌为对照，未发现条带，说明该蛋白带为目的蛋白CagL(图5)。
　　
　　2.7 细胞因子IL8的检测
　　
　　不同浓度的CagL重组蛋白作用的细胞可扩增出IL8片段，阳性对照LPS也出现IL8片段，而阴性对照［PET28a(+)转化的宿主菌平行提取物作用的细胞］及不加处理的细胞未扩增出 IL8 片段（图6）。

　　3 讨论
　　
　　幽门螺杆菌(H.pylori)是一种定植于人类胃黏膜的螺旋状、革兰阴性微需氧菌，其感染呈全球分布，世界人口中大约有50%的人携带有H.pylori。现已证实H.pylori感染是慢性胃炎、十二指肠溃疡的重要病因，并与胃腺癌和胃黏膜相关性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤的发病也有密切关系［5］，已被世界卫生组织国际癌症研究机构列为第一类致癌原［6］。在H.pylori中cagPAI基因呈高密度分布并编码一个分泌转运系统，这个系统主要由11种VirB蛋白同源物和一种偶联蛋白VirD4组成，并且跨越细菌内外膜［7］，通过其将细胞相关毒素转运到宿主细胞，从而参与H.pylori诱导胃上皮细胞发生各种病理变化，主要包括细胞内的酪氨酸磷酸化、细胞骨架重排、基垫结构形成、活化核转录因子NFκB、诱导促炎症细胞因子IL8的表达等，在H.pylori致病中起着关键作用［8，9］。
　　
　　炎症反应是H.pylori感染致病的重要机制之一，IL8作为中性粒细胞趋化及活化因子，在H.pylori致病中起重要的中介作用［10］。有报道称CagA阳性的H.pylori诱导IL8表达的能力远远大于CagA阴性的菌株［11］，而CagA本身并非IL8产生所必需的，这提示IL8的生成存在多种调控因素，但CagA进入宿主细胞后能被磷酸化并与SHP2磷酸酪氨酸连接，引起生长因子样细胞反应和宿主细胞分泌细胞因子［12］，从而介导宿主细胞的损害和疾病的发生。
　　
　　CagL为幽门螺杆菌外膜伴侣蛋白的一种，由cag PAI编码并表达于幽门螺杆菌分泌转运系统纤毛上，对于分泌系统的转运功能，特别是对于分泌装置的形成，底物蛋白的识别以及对随后细胞信号转导的影响都有着十分重要的作用［13，14］。现已有报道证实，在幽门螺杆菌感染过程中，CagL蛋白通过其肽链上的一段RGD基序首先与细胞表面的整合素受体α5β1相互作用，从而启动细胞毒素相关蛋白CagA注入宿主细胞之中［2］，因此可以认为CagL蛋白在幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统纤毛上作为一种传感器或者外源凝集素介导细胞毒素相关蛋白CagA注入与其接触的宿主细胞中，并且，已易位的CagA在其易位点即可发生酪氨酸磷酸化。有研究表明，这是由于CagL蛋白通过与整合素受体相互作用启动整合素信号，从而激活粘着斑激酶（focal adhesion kinase， FAK）以及Src家族激酶［15］。因此我们可以看到CagL蛋白的功能不仅仅限于幽门螺杆菌Ⅳ型分泌系统与宿主细胞之间作为一种外源凝集素，而且通过连接到整合素参与了细胞的信号转导。
　　
　　本研究通过克隆H.pylori NCTC11637菌株中cagL基因，并对其DNA序列进行了测定，同时，利用生物信息数据库及生物学软件对cagL基因的序列同源性和保守性、编码蛋白理化特性及抗原表位进行了分析。经RTPCR检测到CagL可诱导IL8 mRNA的表达。为进一步研究H.pylori致病机制以及H.pylori候选疫苗的筛选奠定了基础。

参考文献

　　［1］Tanaka J， Suzuki T， Mimuro H， et al. Structural definition on the surface of Helicobacter pylori type Ⅳ secretion apparatus［J］.Cell Microbiol，2003，5(6):395-404.

　　［2］Kwok T， Zabler D， Urman S， et al. Helicobacter exploits integrin for type IV secretion and kinase activation［J］.Nature，2007， 449(7164):862-866.

　　［3］Wessler S， Backert S. Molecular mechanisms of epithelialbarrier disruption by Helicobacter pylori［J］.Trends Microbiol，2008，16(8):397-405.

　　［4］Yamada H， Aihara T， Okabe S. Mechanism for Helicobacter pylori stimulation of interleukin8 production in a gastric epithelial cell line(MKN 28): roles of mitogenactivated protein kinase and interleukin1beta［J］. Biochem Pharmacol，2001，61(12): 1595-1604.

　　［5］Sanders MK， Peura DA. Helicobacter pyloriassociated diseases［J］. Curr Gastroenterol Rep，2002， 4(6): 448-454.

　　［6］Gotto T， Nishizono A， Fujioka T， et al. Local secretory immunoglobulin A and postimmunization gastritis correlate with protection against Helicobacter pylori infection after oral vaccination of mice［J］. Infect Immun，1999，67(5):2531-2539.

　　［7］Rohde M， Puls J， Buhrdorf R， et al. A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type Ⅳ secretion system［J］. Mol Microbiol，2003，49(1): 219-234.

　　［8］Shibata W， Hirata Y， Yoshida H， et al. NFκB and ERKsignaling pathways contribute to the gene expression induced by cag PAIpositiveHelicobacter pylori infection［J］. World J Gastroenterol，2005， 11(39): 6134-6143.

　　［9］Oliveira MJ， Costa AC， Costa AM， et al. Helicobacter pylori induces gastric epithelial cell invasion in a cMet and type IV secretion systemdependent manner［J］. J Biol Chem，2006， 281(46): 34888-34896.

　　［10］刘炯. 幽门螺杆菌感染与IL8表达的关系［J］. 国外医学:内科学分册，1999， 26(12): 527-529.

　　［11］Kim SY， Lee YC， Kim HK， et al. Helicobacter pylori CagA transfection of gastric epithelial cells induces interleukin8［J］. Cell Microbiol，2006， 8(1): 97-106.

　　［12］Hatakeyama M. SagA of CagA in Helicobacter pylori pathogenesis［J］.Curr Opin Microbiol，2008，11(1):30-37.

　　［13］Craig L， Li J. Type Ⅳ pili: paradoxes in form and function［J］. Curr Opin Struct Biol，2008，18(2):267-277.

　　［14］Backert S， Selbach M. Role of type Ⅳ secretion in Helicobacter pylori pathogenesis［J］.Cell Microbiol，2008，10(8)：1573-1581.

　　［15］Mitra SK， Schlaepfer DD. Integrinregulated FAKSrc signaling in normal and cancer cells［J］.Curr Opin Cell Biol，2006， 18(5):516-523.