血管内皮生长因子对胃癌BGC823细胞多药耐药相关蛋白1启动子活性的影响

　　　　　　 作者：李娟， 许文林， 弓晋灵， 杨靖， 吴晓君， 陈巧云

【摘要】 目的： 检测血管内皮生长因子(VEGF)对多药耐药相关蛋白1(MRP1)基因启动子转录活性的影响并初步探讨其作用机制。方法： 合成MRP1启动子片段，克隆到荧光素酶报告基因载体PGL3Basic中;用脂质体2000将重组的报告基因载体与内参质粒β半乳糖苷酶(βgal)瞬时共同转染人胃癌BGC823细胞，检测VEGF作用后MRP1启动子活性的改变;继之，采用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002预处理转染的细胞，再检测VEGF对MRP1启动子转录活性的影响。结果： 酶切鉴定和DNA序列分析表明成功地构建了重组PGL3BasicMRP1载体;荧光素酶活性分析表明重组PGL3BasicMRP1在BGC823细胞中具有启动子活性(144±3.0)，与空载体PGL3Basic(60±4.910)相比，转录活性增高2.4倍，差异有统计学意义(P&<0.01);VEGF能以剂量依赖的方式上调MRP1启动子区的转录活性，与无VEGF作用组(171±6.083)相比，最大活性(924±19.975)增高5.4倍(P&<0.05);LY294002能够显著抑制VEGF对MRP1启动子区的转录激活，当LY294002浓度为50 μmol/ml时，MRP1启动子活性(392±25.541)与无LY294002作用组(1 001±11.533)相比下降2.5倍(P&<0.05)。结论： VEGF对MRP1启动子活性具有上调作用，PI3K/AKT信号通路在这一过程中发挥了重要作用。

【关键词】 多药耐药相关蛋白1; 血管内皮生长因子; 荧光素酶报告基因; 启动子活性

　　[Abstract] Objective: To assess the efficacy and mechanism of vascular endothelial growth factor(VEGF) on the transcriptional activity of the the multidrug resistanceassociated protein 1(MRP1) promoter. Methods： The promoter of MRP1 was synthesized and cloned into the luciferase reporter gene vector PGL3Basic.The recombinant plasmid was transiently cotransfected into BGC823 cells with control vector βgal by lipofectamine 2000 reagent， and then detected the alteration of the MRP1 promoter activity after being treated with VEGF.Subsequently，pretreated cotransfected cells with PI3K/AKT signaling pathway inhibitor LY294002，and then evaluated the effect of VEGF on the MRP1 promoter activity. Results： The consequence of restriction enzyme digestion and nucleotide sequence analysis confirmed that the recombinant plasmid was successfully constructed. The analysis of the luciferase reporter gene activity demonstrated that the recombinant plasmid displayed marked activity(144±3.0) in BGC823 cells，about 2.4fold than that seen with control vector PGL3Basic(60±4.910，P&<0.01).Importantly， this activity was upregulated by VEGF in a dosedependent manner，and the most pronounced activity(924±19.975) was at least 5.4fold above that when cells cultured without VEGF(171±6.083，P&<0.05);Furthermore，LY294002 significantly supressed the effect of VEGF on the MRP1 promoter activity.Compared with cells cultured in the absence of LY294002(1 001±11.533)，the activity of the MRP1 promoter was reduced 2.5fold when cells were exposured to 50 μmol/ml LY294002 (392±25.541) (P&<0.05). Conclusion： VEGF could augment the activity of the MRP1 promoter， and PI3K/AKT signaling pathway was proposed to be a critical factor underlying this mechanism of action.

　　[Key words] multidrug resistanceassociated protein 1; vascular endothelial growth factor; luciferase reporter gene; promoter activity

　　获得性多药耐药(multidrug resistance，MDR)目前仍是恶性肿瘤治疗的主要障碍之一。肿瘤细胞MDR的产生与多种因素有关，其中多药耐药相关蛋白1(MRP1)高度表达是主要机制之一。最近的研究表明，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作为最重要的促血管生成因子之一，不仅在肿瘤的增殖、浸润和转移中起着举足轻重的作用，还可通过增强肿瘤细胞的耐药性来影响肿瘤的生物学行为。我们的前期工作发现，抗VEGF抗体能明显抑制白血病K562细胞MRP1的表达，并且呈较好的量效关系，但其具体机制不明[1]。因此，为了进一步阐明VEGF基因参与恶性肿瘤MDR发生的分子机理，我们构建了含MRP1基因启动子的荧光素酶报告基因载体，并将其转染入人胃癌细胞株BGC823细胞，运用荧光素酶活性分析方法检测VEGF对MRP1基因启动子区转录活性的影响并探讨其作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　人胃癌细胞株BGC823由本实验室保存，用含10%小牛血清的DMEM培养液置于37 ℃、5%CO2培养箱内常规培养。重组PGL3BasicMRP1 报告基因质粒及空载体PGL3Basic由上海捷瑞生物工程有限公司提供，内参质粒β半乳糖苷酶(βgal)由江苏大学基础医学与医学技术学院陈永昌教授惠赠，大肠埃希菌DH5α由本实验室保存，KpnⅠ、NcoⅠ内切酶购自TaKaRa公司，重组人VEGF购自Peprotech公司，转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司， LY294002购自Cell Signaling公司，荧光素酶报告基因检测试剂盒及β半乳糖苷酶报告基因检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

　　1.2 重组PGL3BasicMRP1报告基因质粒的合成

　　对人MRP1基因5′端-2008到+103侧翼序列进行分析后，发现此区域-91到+103序列具有启动子活性[2]，合成这段DNA序列，经KpnⅠ、NcoⅠ双酶切后，连于PGL3Basic荧光素酶报告基因载体上，其中MRP1基因启动子位于报告基因的上游。

　　1.3 重组质粒PGL3BasicMRP1的扩增

　　取1 μg重组质粒PGL3BasicMRP1转化DH5α感受态细菌，转化后的菌体沉淀均匀涂布于含100 μg/ml氨苄西林的LB平板上，待吸收后置于37 ℃培养箱，培养12～16 h。灭菌枪头挑取单菌落，接种于含100 μg/ml氨苄西林的LB液体培养液中，置于37 ℃、200 r/min摇床培养12～16 h。大提质粒，测定含量。KpnⅠ、NcoⅠ进行双酶切反应验证，酶切产物在含有0.5 mg/L溴乙啶的1%琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。

　　1.4 质粒瞬时共同转染人胃癌BGC823细胞

　　取指数生长期人胃癌BGC823细胞株按2.5×105/孔接种于6孔板中，37 ℃、5%CO2培养箱内过夜培养，直到细胞80%融合。在EP管中配制空载体PGL3Basic或重组质粒PGL3BasicMRP1、内参质粒βgal及转染脂质体Lipofectamine 2000复合物。A液:将空载体PGL3Basic或重组质粒PGL3BasicMRP1、内参质粒βgal各1 μg/孔稀释至100 μl/孔不含血清的DMEM培养液中，用加样枪混合均匀，室温静置5 min;B液:将Lipofectamine 2 000 6 μl/孔溶于100 μl/孔不含血清的DMEM培养液中，用加样枪混合均匀，室温静置5 min;将A、B两液混合，室温下静置30 min后加入用无菌PBS洗涤2次的待转染细胞中。37 ℃、5%CO2培养箱常规培养4～6 h，弃去培养液，换含10%小牛血清的DMEM培养液继续培养。

　　1.5 MRP1启动子报告基因自身活性的测定

　　分别将1 μg空载体PGL3Basic或重组质粒PGL3BasicMRP1与1 μg内参质粒βgal瞬时共同转染BGC823细胞，24 h后收集细胞，分别测定荧光素酶和βgal活性。其中βgal活性用于校正细胞转染效率，启动子活性为细胞转染效率校正后的荧光素酶活性。

　　1.6 VEGF对MRP1启动子活性的影响

　　VEGF设4个浓度，即0，0.5，2，8，32 ng/ml。每孔细胞中共同转染1 μg重组质粒PGL3BasicMRP1和1 μg内参质粒βgal，转染4～6 h后换含10%小牛血清的DMEM培养液，加入不同浓度的VEGF分别继续培养6 h、12 h、24 h，测定荧光素酶和βgal活性。

　　1.7 LY294002对VEGF作用下MRP1启动子活性的影响 LY294002设5个浓度，即0，10，20，30，40，50 μmol/ml。每孔细胞中共同转染1 μg重组质粒PGL3BasicMRP1和1 μg内参质粒βgal，转染4～6 h后换含10%小牛血清的DMEM培养液，加入不同浓度的LY294002预处理1 h后，再加入适宜浓度的VEGF继续培养(VEGF的作用浓度和作用时间根据“1.6”实验结果选择)，分别测定荧光素酶和βgal活性。

　　1.8 统计分析

　　采用SPSS13.0软件进行两组资料t检验、直线相关分析及单因素方差分析，结果以均数±标准差(±s)表示，P&<0.05具有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 重组质粒PGL3BasicMRP1的酶切鉴定结果

　　该重组质粒PGL3BasicMRP1有与预期大小(195 bp)相似的插入片段(图1)，且DNA序列分析证实该插入片段为MRP1启动子(图2)。

　　2.2 MRP1启动子活性的测定结果

　　空载体PGL3Basic或重组质粒PGL3BasicMRP1与内参质粒βgal共同瞬时转染BGC823细胞后，测定荧光素酶和βgal活性，并将两者的比值作为衡量MRP1启动子活性的依据。结果显示(图3)，与转染空载体PGL3Basic 组荧光素酶/βgal活性(60±4.910)相比，转染重组质粒PGL3BasicMRP1组(144±3.0)转录活性增高2.4倍，具有显著的统计学意义(P&<0.01)。

　　2.3 VEGF对MRP1启动子活性的影响

　　结果见图4。VEGF作用6 h后，MRP1启动子活性无明显变化(P&>0.05);作用12 h后，MRP1启动子活性明显增强，与VEGF浓度相关，且呈剂量依赖关系，VEGF作用浓度为32 ng/ml时达最大值(924±19.975)，与无VEGF作用组(171±6.083)相比，活性增高5.4倍(P&<0.01);VEGF作用24 h后，MRP1启动子的活性增强，但无明显剂量依赖关系。因此，选取32 ng/ml、12 h分别作为后续实验VEGF的作用浓度和作用时间。

　　2.4 LY294002对VEGF作用下MRP1启动子活性的影响 在BGC823细胞中，瞬时共同转染重组质粒PGL3BasicMRP1与内参质粒β半乳糖苷酶，加入不同剂量的LY294002预处理1 h后，再加入32 ng/ml的VEGF继续培养12 h，检测MRP1启动子活性的改变。结果显示(图5)，LY294002能够抑制VEGF对MRP1启动子活性的上调，但各浓度间无明显线性关系，这一抑制作用在LY294002浓度为50 μmol/ml时最为明显(392±25.541)，与无LY294002作用组(1 001±11.533)相比，活性下降2.5倍(P&<0.01)。

　　3 讨 论

　　MRP1是ATP结合盒式(ATPbinding cassette，ABC)膜转运蛋白超家族成员之一，与其他ATP结合转运蛋白类似，MRP1也是一种跨膜糖蛋白，其跨膜区是介导药物转运的基础[3]。MRP1广泛分布于各种肿瘤组织中，如胃癌、白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌等。Laupeze等[4]对44例急性粒细胞白血病患者进行分析后发现MRP1过度表达的阳性患者术后生存率明显低于阴性患者。因此本研究探讨MRP1基因的调控机制有助于预防和逆转过度表达MRP1的肿瘤细胞的MDR，从而提高患者对化疗药物的敏感性，降低死亡率。

　　VEGF是1989年由Ferrara等[5]从牛垂体滤泡星状细胞培养液中首先纯化出来，并发现具有促血管内皮细胞有丝分裂的活性。VEGF与其特异性受体VEGFR结合之后，引发受体酪氨酸激酶活化，可以激活其下游的PI3K/AKT信号通路，从而发挥其生物学行为[6]。同时，PI3K/AKT信号通路在调控MRP1水平中起着重要作用，利用PI3K抑制剂wortmannin抑制Akt的磷酸化后，MRP1的水平也随之下降[7]。近来研究发现VEGF不仅可以促进肿瘤细胞的增殖，抑制其凋亡，还可增强肿瘤细胞的耐药性。Volm等[8]通过研究31种细胞因子对多柔比星与非小细胞肺肉瘤敏感性的影响，发现耐多柔比星的非小细胞肺癌中VEGF及其受体Flt1表达明显高于对多柔比星敏感的细胞，这提示我们VEGF可能与耐药形成有关。又有研究发现，VEGFR2抑制剂YM359445能抑制耐药肿瘤细胞的生长和新生血管形成[9]。并且，Zhang等[10]发现VEGF165介导的HDMEC多药耐药表型对多种药物耐受，如顺铂、丝裂霉素、VP16、泰素等，而这种保护性作用部分归因于MRP和LRP的上调。因此，VEGF与恶性肿瘤细胞MDR及MRP1之间存在紧密的关联，PI3K/AKT信号通路可能参与了这一作用的发生，但其中具体的机制还有待更深入的探讨。

　　我们的实验以人胃癌BGC823细胞为模型，首次研究VEGF对MRP1启动子区转录活性的影响。结果显示，VEGF能以剂量依赖的方式增强MRP1启动子区的活性，用PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002预处理后，这一作用明显减弱，说明PI3K/AKT信号通路在VEGF激活MRP1转录过程中发挥了重要作用。但是，MRP1基因的转录调控机制非常复杂，其启动子区中含有多个正负调控元件，包括Sp1结合位点、GC丰富区、NE1结合域等，相应地，多种转录因子和阻遏蛋白参与了MRP1基因的表达调控。有研究发现，激活PI3K/AKT信号通路可有效刺激转录因子Sp1磷酸化，使其DNA结合力增加，转录活性增强，进而启动下游基因的转录[11]。因此，对于VEGF及其下游的PI3K/AKT信号通路调控MRP1基因转录的具体机制我们将作进一步的研究。

参考文献

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　　[2] Zhu Q，Center MS. Cloning and sequence analysis of the promoter region of the MRP gene of HL60 cells isolated for resistance to adriamycin[J].Cancer Res，1994，54(16):4488-4492.

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　　[4] Laupeze B，Amiot L，Drenou B， et al. High multidrug resistance protein activity in myeloid leukemias is associated with poor response to chemotherapy and reduced patient survival[J].Br J Haematol，2002，116(4):834-838.

　　[5] Ferrara N，Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparinbinding growth factor specific for vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun，1989，161(2):851-858.

　　[6] Santos SC，Dias S. Internal and external autocrine VEGF/KDR loops regulate survival of subsets of acute leukemia through distinct signaling pathways[J].Blood，2004，103(10):3883-3889.

　　[7] Tazzari PL， Cappellini A， Ricci F， et al. Multidrug resistanceassociated protein 1 expression is under the control of the phosphoinositide 3 kinase/Akt signal transduction network in human acute myelogenous leukemia blasts[J]. Leukemia， 2007， 21 (3): 427-438.

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　　[9] Amino N，Ideyama Y，Yamano M， et al. YM359445，an orally bioavailable vascular endothelial growth factor receptor2 tyrosine kinase inhibitor，has highly potent antitumor activity against established tumors[J]. Clin Cancer Res，2006，12(5):1630-1638.

　　[10] Zhang XS，Zhu XF，Gao JS，et al. Multiple drug resistance phenotype of human endothelial cells induced by vascular endothelial growth factor 165[J].Acta Pharmacol Sin，2001，22(8):731-735.

　　[11] Pore N，Liu S， Shu HK，et al. Sp1 is involved in Aktmediated induction of VEGF expression through an HIF1independent mechanism[J]. Mol Biol Cell，2004，15(11):4841-4853.