SiRNA阻断CD40CD40L对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响

　　　　 作者：严金川， 杨萍， 徐良洁， 王标， 袁伟

【摘要】 目的： 探讨阻断CD40CD40L相互作用对ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响。方法： 采用ApoE-/-小鼠颈动脉硅胶圈植入法快速制作斑块模型，分别应用特异性CD40L抗体及高效siRNACD40慢病毒基因片段干预小鼠，4周后观察斑块形成(HE染色法)。结果： CD40L抗体100 μg/100 μl PBS注射ApoE-/-小鼠组颈动脉斑块面积较对照组减少48.3%，siRNACD40慢病毒基因片段组小鼠颈动脉斑块面积减少58.6%。结论： 高效siRNACD40基因片段能通过阻断CD40CD40L抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成。

【关键词】 CD40; RNA干扰; 动脉粥样硬化; 小鼠

　Effect of siRNA interruption of CD40CD40L interaction on the

　　atherosclerotic plaque in ApoE-/- mice

　　YAN Jinchuan， YANG Ping， XU Liangjie， WANG Biao， YUAN Wei

　　(Department of Cardiology， the Affiliated Hospital of Jiangsu University， Zhenjiang Jiangsu 212001， China)

　　[Abstract] Objective: To investigate the effect of interruption of CD40CD40L interaction on the atherosclerotic plaque in ApoE-/- mice. Methods: Carotid atherosclerotic lesions model was rapidly induced by perivascular collar placement in ApoE-/-. The ApoE-/- mice were treated with antiCD40L antibody and high effective siRNACD40 lentivirus respectively. The atherosclerotic plaques were detected by hematoxylin and eosinstained after 4 weeks. Results: Compared with the experimental and control， atherosclerotic plaques areas of ApoE-/- mice were decreased by 48.3% and 58.6% in antiCD40L antibody and siRNACD40 groups respectively. Conclusion: The high effective siRNACD40 can significant depressed the formation of atherosclerotic plaques through interruption of CD40CD40L interaction in ApoE-/- mice.

　　[Key words] CD40; RNA interfering; atherosclerosis; mice

　　近年来的研究发现，CD40CD40L这一对受体配体参与了动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)斑块的形成和发展。它们相互作用可激活AS斑块中的巨噬细胞、单核细胞及T淋巴细胞分泌产生在斑块稳定中起关键作用的成分，如黏附分子、细胞因子、基质金属蛋白酶和组织因子等[1]。因此，CD40CD40L之间的相互作用能介导免疫反应，加速AS的发生和发展并触发斑块的破裂。CD40CD40L受体配体在AS斑块局部炎症反应和血栓形成过程中起着举足轻重的调控作用，阻断该受体-配体有望达到稳定斑块、抑制血栓形成的双重功效，目前CD40CD40L被认为是防治AS斑块形成极有前途的治疗靶点[2]。本研究采用RNA干扰技术阻断CD40CD40L的相互作用，观察AS斑块的形成情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物和材料

　　载脂蛋白 E基因缺陷(ApoE-/-)小鼠，体质量 18～20 g，雄性8周龄，购自北京维通利华有限公司(动物许可证编号SCXK京2006-0008)，内径为0.3 mm硅胶管购自Dow Corning 公司。

　　1.2 试 剂

　　鼠CD40L单克隆抗体购自Pharmingen公司，CD40RNAiLV慢病毒载体由上海吉凯基因化学技术有限公司包装(CD40siRNA基因片段，正向5′GCAGGUGACAGACAGCAUAdTdT3′，反向3′dTdTCGUCCACUGUCUGUCGUAU5′)。高脂饲料配方: 0.3%胆固醇、10%猪油、10%蛋黄粉、0.15%胆盐加鼠普通饲料合成(购于北京科奥协力饲料有限公司)。

　　1.3 ApoE-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块模型制作

　　采用颈动脉硅胶圈植入法快速制作斑块模型[3]。麻醉后分离小鼠颈总动脉，硅胶圈内径为0.3 mm，将硅胶圈纵向剪开后包绕颈总动脉，然后用3根丝线分别固定硅胶圈(图1所示)，小鼠颈动脉在80 mmHg灌注压下，颈总动脉外径平均为0.36 mm，因此使用硅胶圈，相当于使颈总动脉狭窄30%，2周后可快速形成明显斑块。所有小鼠从手术当天饲以高脂饮食，自由进食进水。

　　1.4 动物分组

　　将动物模型分为3组，CD40L抗体组(阳性对照，n=6)：CD40L抗体100 μg/100 μl PBS注射ApoE-/-小鼠腹腔，每周2次，共4周。CD40RNAiLV慢病毒组(CD40RNAi组，n=6)：阻断颈总动脉近心段，应用微量注射器将0.2 ml( 4 ×105 TU/ml)CD40RNAiLV局部注射颈动脉斑块处，10 min后开通血流，高脂饮食4周。对照组(n=6)：不进行任何干预，高脂饮食4周。

　　1.5 病理组织学检查

　　术后4周取材，取材前1天晚上禁食不禁水，以氯胺酮 80 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，待麻醉完全后将其仰卧位固定于木板上。以75%乙醇消毒胸腹部皮肤，自剑突下提起皮肤用眼科剪剪开，向上方剪开胸腔皮肤，并以剑突下为入口，剪开胸腔，充分显露视野。于右心耳剪口，从左心室行心脏固定，以4℃预冷的PBS于生理压力下灌注，继之以4%甲醛液固定组织。沿主动脉弓游离右颈动脉，尽量剥离血管外膜的脂肪组织，小心拆除硅管，取下右侧颈动脉，取材范围为沿硅管包绕上下各5 mm， 将标记好的颈动脉放于甲醛溶液中，常规石蜡包埋制成蜡块，行连续切片，将切片固定于载玻片上，行苏木素-伊红染色(hematoxylineosin，HE)，利用显微镜微机彩色图像处理系统进行斑块观察并测量面积。

　　1.6 统计学分析

　　应用 SPSS 13.0软件系统进行统计分析 ，结果用均数±标准差表示。两个均数比较用t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　制模4周后各组取材HE染色示CD40L抗体组和CD40RNAi组ApoE-/-小鼠颈动脉斑块形成明显较对照组轻(图2)，斑块面积分别较对照组减少48.3%和58.6%(图3，P&<0.05)。

　　3 讨 论

　　动脉粥样硬化是一种慢性炎症性血管疾病，严重威胁人类健康。近年来研究发现，CD40CD40L这一对受体配体参与了AS斑块的发生和发展，并触发斑块破裂引起急性心血管事件[4]。我们前期研究发现[5-6]， CD40CD40L广泛表达于AS斑块的巨噬细胞、平滑肌细胞、淋巴细胞和内皮细胞表面，而动脉壁的非斑块区不表达。这一对受体配体在介导急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome， ACS) 血栓形成过程中促进炎症因子释放和平滑肌细胞增殖，增加内皮的促凝活性及血管重塑，诱导基质金属蛋白酶表达，并与oxLDL协同作用促进动脉粥样硬化和斑块的不稳定。抑制或干扰CD40CD40L对防止AS斑块的形成和发展、促进斑快的稳定具有潜在治疗价值[7]。CD40CD40L几乎贯穿AS斑块发生、发展、破裂及血栓形成的全过程[8]，动物模型中也证实应用特异性CD40抗体阻断该受体配体，能明显抑制基因敲除鼠斑块的形成和发展，目前CD40CD40L被认为是抑制斑块形成的治疗靶点之一。为有效阻断CD40/CD40L这对受体配体，国内、外学者[9-10]已进行了多方面的尝试，如单克隆CD40抗体或CD40L抗体、CD40L基因敲除鼠及CD40Fc融合蛋白载体等。上述种种应用直接或间接方法阻断CD40/CD40L受体配体，一方面阻断效率低下，另一方面由于抗体存在免疫原性和免疫反应性，且不能局部使用，限制了进一步的临床推广。

　　本研究采用ApoE基因敲除鼠颈动脉血管外周放置硅管法快速建立动脉粥样硬化斑块模型。我们选择RNA干扰 (RNAi)技术从源头抑制斑块中细胞表达CD40，最终导致CD40L不能或很少与CD40结合，从而达到高效阻断CD40CD40L之间相互作用的目的。siRNA对靶基因的沉默作用具有特异性和高效性，抑制作用强大。我们应用前期已筛选出的高效CD40siRNA包装慢病毒局部干预斑块，结果显示CD40RNAi与特异性CD40L抗体均能抑制斑块形成，从而证实CD40RNAi是通过阻断CD40CD40L之间的相互作用抑制斑块生长。

　　综上所述，CD40RNAi能通过阻断CD40CD40L明显抑制ApoE基因敲除鼠颈动脉粥样硬化斑块的形成和发展，这为进一步防治动脉粥样硬化斑块的发生、发展的临床应用提供了广泛的前景。

参考文献

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