Livin反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响

　　　　 作者：宋萍 郑金旭 管淑红， 邵启祥 李坚

【摘要】 目的： 探讨Livin基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides， ASODN)对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法： 用阳离子脂质体介导Livin ASODN转染至A549细胞，反转录聚合酶链反应(RTPCR)检测Livin基因 mRNA的表达;MTT法检测转染细胞的生长抑制情况。结果： 转染ASODN后A549细胞的Livin 基因mRNA的表达明显减少，Livin 基因ASODN显著抑制A549细胞增殖，并呈剂量依赖性，与对照的错义寡核苷酸(missense oligodeoxynucleotides，MSODN)比较差异有统计学意义(P&<0.05)。结论： Livin反义寡核苷酸能明显抑制A549细胞Livin基因 mRNA的表达，抑制细胞增殖，Livin基因有望成为肺癌基因治疗的新靶点。

【关键词】 肺癌; 反义寡核苷酸;Livin

　　[Abstract] Objective: To explore the effects antisense oligodeoxynucleotides(ASODN)of Livin mRNA on the proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells. Methods: Livin ASODN was transfected into A549 cells mediated by lipofectamine 2000. The expressions of Livin mRNA was detected by RTPCR. The proliferation rates of A549 cells were assessed by the MTT assay. Results: It was observed that the expressions of Livin mRNA in ASODN group were decreased in a concentration dependent manner. The cell growth inhibition was evidently increased in the ASODN transfected cells.The difference was significant compared with cells in Livin missense oligodeoxynucleotides (MSODN)(P&<0.05). Conclusion: Livin ASODN significantly down regulated the expression of Livin mRNA and increased growth inhibition in A549 cells. Therefore Livin gene may become a new molecular target for gene therapy for lung cancer.

　　[Key words] lung cancer; antisense oligodeoxynucleotides; Livin

　　肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，由于肺癌早期无典型特异症状 ， 初诊时大多数患者已属于局部晚期或发生远处转移，全身化疗是此类患者治疗的主要手段，但是肺癌尤其是非小细胞肺癌的化疗效果多不理想，靶向治疗为提高肺癌疗效提供了的一条颇具希望的新途径。Livin是凋亡抑制蛋白家族中的一个重要成员，在多数恶性肿瘤组织中表达增高。本研究旨在通过Livin反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides， ASODN)转染A549细胞，观察对肺腺癌细胞A549增殖的影响，探讨Livin作为肺癌新靶点治疗的可能性。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　DMEM培养基(Gibco公司);小牛血清(甘肃兰州民海生物科技有限公司);噻唑蓝，二甲亚砜(Amresco公司);LipofectamineTM 2000，Trizol(Invitrogen 公司);ReverAid试剂盒(Mbi公司);Ex Taq酶为TaKaRa公司产品;人肺癌细胞A549由江苏大学生命科学院提供。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞培养 A549细胞选用含10%小牛血清的DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2的饱和湿度恒温细胞培养箱中培养。

　　1.2.2 寡核苷酸的设计与合成 ASODN及错义寡核苷酸(missense oligodeoxynucleotides，MSODN)序列参照文献[1]，由上海生工生物工程有限公司合成，并对寡核苷酸进行硫代磷酸化修饰，以提高其血清稳定性。反义序列为5′ACCATCACCGGCTGCCCAGT3′; 错义序列为5′GTCAGGATCTTCCCACGGAG3′。

　　1.2.3 细胞转染及分组 当细胞进入对数生长期后，0.25%胰酶消化接种，待细胞贴壁融合达70%，换成无血清培养基。按照LipofectamineTM2000试剂说明书将脂质体分别与ASODN和MSODN在无血清培养基中混合，制成脂质体寡核苷酸复合物(LipASODN和LipMSODN)。根据处理A549细胞的方式不同分为6组：加入LipASODN终浓度为200 nmol/L的A200组，终浓度为400 nmol/L的A400组，终浓度为600 nmol/L的A600组;加入LipMSODN终浓度为200 nmol/L的M200组;只加入脂质体的Lip对照组;同时设未加任何处理的空白对照组。细胞转染6 h后更换含血清培养基，继续培养48 h。

　　1.2.4 RTPCR 检测Livin mRNA表达 于转染后48 h收集各组细胞，用Trizol提取总RNA，经紫外分光光度仪检测总RNA浓度后，用ReverAid试剂盒获得cDNA。参考Livin基因序列设计引物，上游引物序列:5′CTGAGGAGTTGCGTCTGGC3′，下游引物序列：5′GCACGGCACAAAGACGAT3′，扩增片段长度为545 bp。另设计看家基因GAPDH作为内参照，上游引物序列为：5′GGATTTGGTCGTATTGGG3′，下游引物序列为：5′GGAAGATGGTGATGGGATT3′，扩增片段长度为205 bp。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增条件：94℃变性5 min，95℃ 30 s，55℃退火30 s，延伸 72℃ 30 s，36个循环。PCR产物经2%琼脂糖电泳鉴定。目的基因Livin mRNA的相对表达量以Livin/GAPDH灰度比值表示。

　　1.2.5 MTT法检测A549细胞转染后的生长抑制率 当细胞进入对数生长期后，0.25%胰酶消化，用培养基调整其浓度为1×105/ml，每次取100 μl接种于96孔板，当细胞贴壁融合达70%时转染。转染48 h后每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl孵育培养4 h，弃去上清液，每孔分别加入二甲亚砜(DMSO)150 μl，室温下震荡15 min，用酶标仪测定490 nm处光密度值。每组设5个复孔，计算细胞的生存率(%)=(实验组D值/对照组D值)×100%。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS 10.0统计软件进行方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 转染后A549细胞Livin mRNA表达的变化

　　转染A549细胞48 h后收集细胞，采用RTPCR方法检测Livin mRNA表达， LipASODN几个浓度组的Livin mRNA相对表达量低于M200组(1.68±0.07)、Lip对照组(1.65±0.08)及空白对照组(1.70±0.08)(P&<0.05)。并且随LipASODN终浓度的增高，Livin mRNA相对表达量减少(A200组为1.43±0.06，A400组为0.99±0.04，A600组为0.57±0.05)。见图1。

　　2.2 MTT法检测ASODN对A549细胞增殖抑制的影响

　　不同浓度Livin ASODN处理A549细胞，MTT法检测分析显示A549细胞生存率均下降，细胞增殖受到抑制，呈剂量依赖性，而Lip对照组和M200组细胞生存率下降不明显，细胞增殖无明显抑制(表1)。表1 Livin ASODN对A549细胞增殖的影响

　　3 讨 论

　　大部分肺癌患者发现时已是肿瘤晚期，化疗是肺癌综合性治疗的重要手段之一，但常因肿瘤细胞的耐药而导致化疗失败，寻求肿瘤特异靶点进行靶向治疗是目前肿瘤研究的热点之一。近年来研究发现细胞凋亡相关基因异常表达，不仅与肿瘤的发生、发展有关，而且在肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药中发挥了重要作用，凋亡负性调控基因的过度表达致使肿瘤抗凋亡能力增强，而导致肿瘤细胞的耐药。

　　凋亡抑制蛋白家族是独立于Bcl2的一类抗凋亡蛋白[2]。Livin是2000年发现的凋亡抑制蛋白家族中的新成员，基因定位于染色体20q13.3，全长4.6 kb，包含7个外显子及6个内含子，因剪接方式的不同有两种异构体Livin α和 Livin β，有研究认为它们在功能上没有本质差别[3]。Livin特有的BIR 结构域与Caspases蛋白家族中的多个成员相互作用发挥抗凋亡的作用[4]。已有研究显示 Livin 在膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、肾癌、肝癌等多数肿瘤中有特异性的高表达，而在正常组织中不表达或低表达[5-9]，这就可能为肿瘤基因治疗提供了靶点。近来研究发现，Livin与化疗耐受有关。Wang等[10]在对结肠癌HCT8/V 细胞研究中发现， 高表达Livin的 HCT8/V细胞对多种化疗药产生耐受，减少Livin表达可促进细胞凋亡，提高HCT8/V细胞对多种化疗药物的敏感性。

　　ASODN是一种人工合成的单链片段，通过碱基互补原则能与特定的DNA或RNA结合，阻止基因转录与翻译，从而特异地阻断目的基因的表达，而不影响其他基因的正常功能。寡核苷酸经硫代磷酸修饰后可提高耐受核酸水解的能力及转染效率。ASODN技术由于能选择性抑制基因表达具有广阔的应用前景。本研究以A549细胞为研究对象，以全硫代磷酸化修饰Livin ASODN，同时合成MSODN作为对照来证明ASODN抑制作用的特异性，采用阳离子脂质体LipofectamineTM2000转染细胞，结果显示肺腺癌A549细胞经ASODN转染后，Livin基因mRNA的表达明显减少，而MSODN的Livin mRNA表达无明显变化。随着ASODN浓度的增高，对Livin mRNA 的阻断作用逐渐增强，细胞增殖受到抑制的程度也随之增高，而MSODN转染组对细胞增殖无明显抑制作用，可能机制为ASODN封闭Livin基因mRNA的表达，抑制了细胞增殖。总之，我们的研究结果表明，Livin反义寡核苷酸可抑制肺癌细胞Livin基因表达，并通过此途径抑制肺癌细胞增殖，Livin有可能成为肺癌基因治疗的新靶点，ASODN治疗肺癌可能是一种颇有希望的肿瘤治疗新方法。

参考文献

　[1] 刘 川，吴小候，张唯力，等. Livin反义寡核苷酸诱导人肾癌细胞凋亡及其机制的研究[J].第三军医大学学报， 2008，30(17): 1622-1625.

　　[2] Lopes RB，Gangeswaran R，McNeish IA，et al.Expression of the IAP protein family is dysregulated in pancreatic cancer cells and is important for resistance to chemotherapy [J].Int J Cancer， 2007，120(11):2344-2352.

　　[3] CmkovicMertens I，HoppeSeyler F，Butz K. Induction of apoptosis in tumor cells by siRNAmediated silencing of the livin/MLIAP/KIAP gene[J]. Oncoqene，2003，22(51):8330-8336.

　　[4] Chang H， Schimmer AD. Livin/melanoma inhibitor of apoptosis protein as a potential therapeutic target for the treatment of malignancy [J]. Mol Cancer Ther ， 2007， 6(1):24-30.

　　[5] Takeuchi H， Morton DL， Elashoff D， et al. Survivin expression by metastatic melanoma predicts poor disease outcome in patients receiving adjuvant polyvalent vaccine[J]. Int J Cancer， 2005，117(6):1032-1038.

　　[6] Zhu Z， Wang Y， DingX， et al. Expression and prognostic significance of Livin in the progression of bladder cancer[J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci， 2008 ，28(1):90-92.

　　[7] Tanabe H， Yaqihashi A， Tsuji N， et al. Expression of survivin mRNA and livin mRNA in nonsmallcell lung cancer[J].Lung cancer，2004， 46(3):299-304.

　　[8] Kempkensteffen C， Hinz S， Christoph F，et al. Expression of the apoptosis inhibitor livin in renal cell carcinomas: correlations with pathology and outcome[J].Tumour Biol， 2007，28(3):132-138.

　　[9] Augello C， Caruso L， Maggioni M，et al. Inhibitors of apoptosis proteins (IAPs) expression and their prognostic significance in hepatocellular carcinoma[J].BMC Cancer， 2009，9:125.

　　[10] Wang X， Xu J， Ju S， et al. Livin gene plays a role in drug resistance of colon cancer cells[J]. Clin Biochem，2010， 43(7/8):655-660.