氟伐他汀对高血压肾脏硬化大鼠肾脏细胞凋亡的影响

　　　　 作者：华云， 韩枫， 李爱梅， 夏春英， 张国辉

【摘要】 目的： 探讨羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂氟伐他汀对氧化亚氮缺乏性高血压大鼠肾脏细胞凋亡的影响。方法： 给予左旋硝基精氨酸甲酯(Lnitroargininemethylester，LNAME)建立氧化亚氮缺乏性高血压肾脏硬化大鼠模型，观察氟伐他汀对高血压肾脏硬化大鼠Fas、FasL、Bax和Bcl2蛋白表达水平的影响。结果： 氟伐他汀使高血压肾脏硬化大鼠凋亡蛋白Fas、FasL、Bax表达减少，抗凋亡蛋白Bcl2表达增加。结论： 氟伐他汀能够改善高血压肾脏硬化，调节细胞凋亡水平可能是其机制之一。

【关键词】 高血压肾脏硬化; 氟伐他汀; 细胞凋亡

　　[Abstract] Objective: To assess the apoptosis occurring in the kidney of SD rats induced by Lnitroargininemethylester(LNAME)over time and investigate the effects of fluvastatin treatment. Methods： Male SD rats were administered by LNAME to form hypertensive nephropathy，then the rats were administered by fluvastatin，at last the rats had their kidneys removed to measure protein expression of Fas，FasL，Bax and Bcl2 genes by Western blot. Pathologic measurement had been taken. Results: After fluvastatin treatment the protein expression of Fas， FasL and Bax were more depressed and the protein expression of Bcl2 was higher. Conclusion：Fluvastatin prevented or retarded hypertensioninduced renal nephropathy via inhibition of renal nephropathy fibrosis，the apoptosis might be one of the mechanisms.

　　[Key words] hypertensive nephropathy; fluvastatin; apoptosis

　　近来，随着我国人口的老龄化和人们生活方式的改变，原发性高血压的患病率逐年升高，高血压所导致的终末期肾衰发生率呈上升趋势，在终末期肾衰竭患者中，高血压肾脏硬化占第二位[1]。氟伐他汀是一种新型的3羟基3甲基戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶抑制剂，不仅具有降脂作用，还是有一定的肾保护作用[2]。本实验通过观察大鼠肾脏凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的变化，以探讨氟伐他汀对高血压肾脏硬化大鼠肾脏细胞凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠30只，体质量(230±20)g，由江苏大学医学院实验动物中心提供。

　　1.1.2 药品及试剂 左旋硝基精氨酸甲酯(Lnitroargininemethylester，LNAME，Sigma公司)，氯胺酮(江苏恒瑞医药有限公司)，氟伐他汀(北京诺华制药公司)，Fas、FasL、Bax和Bcl2抗体(南京凯基生物工程有限公司)。

　　1.1.3 实验仪器 无创尾动脉血压分析系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)，病理切片机(德国Leica RM2135)，显微照相及图像分析系统(德国Leica QWIN3)，凝胶成像系统(美国BIORAD公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 大鼠分组及模型制备 选择健康成年雄性SD大鼠30只，随机取20只大鼠制备高血压肾脏硬化模型，另10只在相同条件下饲养，设为正常对照组。造模大鼠予LNAME 50 mg·kg-1·d-1灌胃给药，8周后造模成功的15只大鼠随机分为两组，一组为氟伐他汀组(8只)：给予5 mg·kg-1.d-1氟伐他汀灌胃，共8周;另一组为高血压肾脏硬化组(7只)：予等量生理盐水灌胃，共8周，每周测量各组大鼠体质量，根据体质量调整药物剂量。

　　1.2.2 血压的测定 第0，2，4，6，8，10，12，14，16周予尾动脉测血压，收缩压≥140 mmHg定为高血压。

　　1.2.3 组织标本的采集 给药结束后无痛处死大鼠，取出肾脏，并用冰生理盐水经肾动脉冲洗至发白，标本一部分用4%低聚甲醛固定，石蜡包埋制备切片，行HE和Masson染色，由两位病理科医生进行肾小球硬化评分：观察5个视野20个肾小球，计算每个肾小球内细胞数，再取平均值，计算出单个肾小球内细胞数;根据每个肾小球变性坏死程度、单个肾小球内细胞数、系膜基质区大小、毛细血管狭窄或扩张程度及球囊粘连程度等，进行损伤性评分：没有损伤记为0分，轻度损伤记1分，中度损伤记2分，重度损伤记3分，几乎完全损伤记4分。肾小球损伤指数=(1×n1/20+2×n2/20+3×n3/20+4×n4/20) ×100，其中n分别代表不同损伤程度的肾小球个数。

　　1.2.4 细胞凋亡的检测 采用蛋白质印迹方法测定Fas、FasL、Bax和Bcl2蛋白浓度。首先将肾皮质称重，加入裂解液以及蛋白酶抑制剂，制作匀浆，按比例配制分离胶和浓缩胶，加样后电泳，转膜，封闭抗体杂交，最后将PVDF膜放入 BIORAD凝胶成像系统，用软件计算灰度值。

　　1.2.5 统计学分析 所有资料采用SPSS11.5软件处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较用单因素方差分析，两组比较用LSD法。

　　　　 2 结 果

　　2.1 各组大鼠收缩压的变化

　　LNAME灌胃后，造模大鼠2周血压即升高，到第4周时形成稳定的高血压模型，4周时收缩压&>140 mmHg，均达到高血压诊断标准。8周时正常对照组收缩压为(102.6±6.48)mmHg，高血压肾脏硬化组为(213.8±13.44)mmHg，氟伐他汀组为(216.6±11.44)mmHg，高血压肾脏硬化组和氟伐他汀组相比，血压的差异无统计学意义(P&>0.05)。16周时正常对照组收缩压为(106.7±7.26)mmHg，高血压肾脏硬化组为(207.3±11.53)mmHg，氟伐他汀组为(199.3±11.61)mmHg，高血压肾脏硬化组和氟伐他汀组相比，血压的差异无统计学意义(P&>0.05)，氟伐他汀对血压没有影响，见图1。

　　2.2 肾脏病理变化

　　与正常对照组相比，高血压肾脏硬化组大鼠多数肾小球存在严重硬化，肾小球萎缩，囊腔缩小，球囊明显粘连，重度系膜细胞增生，基底膜增厚明显，单个肾小球内细胞数增多，HE染色可见系膜旁及系膜区嗜红物质基质沉积，见图2。Masson染色可见肾小球内有较强的基质胶原阳性染色(蓝色)，见图3。高血压肾脏硬化组的肾小球内细胞数、肾小球硬化评分与正常对照组比较显著提高，两组比较差异有统计学意义(P&<0.05)。氟伐他汀组与高血压肾脏硬化组相比较，两项指标明显好转，见表1。表1 各组肾小球硬化评分和肾小球内细胞数比较

　　2.3 细胞凋亡的检测结果

　　高血压肾脏硬化组肾皮质的Bax、Fas和FasL 蛋白表达水平显著高于正常对照组，Bcl2蛋白表达水平显著低于正常对照组，两组比较差异有统计学意义(P&<0.05);而氟伐他汀组Bax、Fas和FasL蛋白表达水平与高血压肾脏硬化组比较显著降低，Bcl2蛋白表达水平与高血压肾脏硬化组比较显著升高，两组比较差异有统计学意义(P&<0.05)。见图4、5和表2。表2 各组大鼠Bax、Bcl2、Fas和FasL蛋白灰度值表达与正常对照组比较，a：P&<0.05;与高血压肾脏硬化组比较，b：P&<0.05

　　3 讨 论

　　细胞凋亡和细胞增生共同调节肾脏各部分细胞总量的平衡，细胞凋亡可参与高血压肾脏硬化的发生， 并在调节靶器官细胞数量方面发挥重要作用。高血压可能作为一种触发因素， 激活凋亡基因表达， 从而诱导或抑制细胞凋亡， 参与高血压所致肾损害。

　　本研究结果表明，高血压肾脏硬化组的Fas、FasL和Bax蛋白水平明显高于正常对照组，而Bcl2蛋白水平低于正常对照组。目前认为肾实质细胞的凋亡是高血压肾脏硬化的重要机制之一，细胞凋亡是肾小球硬化时肾小球细胞清除的重要形式。高血压时肾实质细胞凋亡增加与下列因素有关：① 系膜细胞分泌的异常细胞外基质。在人肾小球肾炎和大鼠肾小球硬化模型中，系膜细胞凋亡主要出现在细胞外基质成分和结构发生改变的时期，提示在进行性肾小球硬化时，肾小球细胞凋亡可能受其周围细胞外基质的控制。② TGFβ1的增加。新近的研究发现TGFβ1对肾小球细胞是否发生凋亡也起重要调控作用，TGFβ1可诱导体外培养的肾小球足突细胞凋亡[3]。氟伐他汀使用8周后Fas和FasL的蛋白水平明显低于高血压肾脏硬化组，并且促凋亡基因Bax蛋白水平显著低于高血压肾脏硬化组，而抗凋亡基因Bcl2的蛋白水平显著高于高血压肾脏硬化组。氟伐他汀可能通过减少肾实质细胞的凋亡，改善肾脏硬化。已有研究表明，他汀类药物能够抑制细胞凋亡，辛伐他汀对糖尿病肾病晚期细胞凋亡有一定的抑制作用[4]。Mizuguchi等[5]研究表明，阿伐他汀显著抑制单侧输尿管梗阻模型大鼠肾小管上皮细胞凋亡，促进肾小管上皮细胞的再生。Usui等[6]研究表明，他汀类药物通过抑制法呢基焦磷酸(FPP)和拢牛儿基拢牛儿焦磷酸(GGPP)的产生，阻断了由Ras介导的细胞内信号传递，从而引起肾脏细胞的凋亡减少。他汀减少了小G蛋白p21RhoB的异戊二烯化，从而减少了血管平滑肌细胞的凋亡，通过调节信号途径而减少了细胞的凋亡。

　　我们认为在高血压肾脏硬化后期以肾实质细胞凋亡为主要表现时，他汀类药物可通过降低TGFβ1的作用而达到抑制细胞凋亡的作用。Zhang等[7]发现阿伐他汀治疗大鼠异体移植肾脏时，可降低TGFβ1的表达。体外研究也表明他汀类药物可降低TGFβ1的表达，可能是通过降低血管紧张素Ⅱ来下调其表达的[8]。另一方面他汀类药物可通过调节纤溶酶原减少细胞外基质沉积而减少细胞凋亡。他汀可通过调节纤溶酶原系统的活性使失活的纤溶酶原再生。董一飞等[8]研究表明，无论在mRNA水平还是蛋白水平，阿伐他汀都能明显抑制胶原Ⅰ和纤溶酶原激活物抑制剂1的表达，表明阿伐他汀能影响系膜细胞的细胞外基质合成和降解，改善大鼠系膜细胞的细胞外基质积聚。他汀通过减少细胞外基质沉积，使受其控制的肾小球细胞凋亡受到抑制。

　　因此，我们认为氟伐他汀可能通过减少细胞外基质沉积和降低TGFβ1的表达而抑制了肾实质细胞的凋亡，改善了高血压肾脏硬化。

参考文献

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　　[5] Mizuguchi Y，Miyajima A，Kosaka T，et al.Atorvastatin ameliorates renal tissue damage in unilateral obstruction[J]. J Urol，2004，172(6 Pt 1):2456-2459.

　　[6] Usui H， Shikata K， Matsuda M，et al. HMGCoA reductase inhibitor ameliorates diabetic nephropathy by its pleiotropic effects in rats[J]. Nephrol Dial Transplant，2003，18(2):265-272.

　　[7] Zhang W， Liu M， Wu Y， et al. Protective effects of atorvastatin on chronic allograft nephropathy in rats[J].J Surg Res，2007，143(2): 428-436.

　　[8] 董一飞，程晓曙，杨人强，等.高压诱导大鼠系膜细胞细胞外基质积聚机制及阿托伐他汀的干预作用[J].中华肾脏病杂志，2005，21(5):274-277.