生存素启动子调控HSV1TK真核表达载体的构建及其对A549肺癌细胞系的杀伤作用

【摘要】 目的： 构建生存素(survivin，SURV)启动子调控的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1TK)基因表达载体，检测该启动子的活性和特异性，观察该基因对大鼠体内肺癌生长的抑制功能。 方法： 酶切回收SURV启动子、CMV启动子;PCR扩增HSV1TK基因;将上述片段与含有报告基因荧光素酶基因(Luciferase，Luc)的载体pGL3Basic的多克隆位点连接，分别构建成为SURV、CMV启动子调控的HSV1TK、Luc真核表达载体(pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc)，用脂质体法将表达载体转染A549细胞系，蛋白质印迹法检测TK基因的表达，更昔洛韦细胞毒实验观察TK蛋白的酶活性，肿瘤生长抑制实验证实pSURVTK的抑瘤功能。 结果： 成功地将SURV基因启动子、CMV启动子，HSV1TK克隆到报告基因载体pGL3 的多克隆位点，酶切鉴定和DNA 序列分析无误， 蛋白质印迹证实pSURVTK在肺癌细胞A549中可特异性表达出TK蛋白，更昔洛韦细胞毒实验表明表达的TK蛋白具有酶活性，并可有效抑制体内肺癌的生长。 结论： SURV启动子调控的TK基因治疗载体，可特异性调控TK基因在A594肺癌细胞的表达并抑制肺癌细胞的生长，为应用自杀基因治疗肺癌提供了新的途径。

【关键词】 肺癌; 基因治疗; 生存素; 启动子; 单纯疱疹病毒1型胸苷激酶

　[Abstract] Objective: To construct a lung cancer specific the herpes simplex virus 1 thymidine kinase (HSV1TK) expression vector regulated by survivin promoter (SURV) and detect its activation and potential to inhibit the grow of lung cancer in vivo. Methods: Plasmid pGL3TK was obtained by substituting the luciferase cassette with a PCR product corresponding to TK with flanking Nco Ⅰ and Xho Ⅰ sites. To obtain the pSURVTK and pCMVTK two versions， the SURV and CMV cassettes were excised with Bgl Ⅱ and Hand Ⅲ and cloned into the respective sites of the vector. Recombinant plasmid pSURVTK and pCMVTK were transfected into survivin positive or negative cell lines by the means of lipofectamine. The expression of HSV1TK was tested by Western Blotting， Ganciclovir cytotoxicity assay to evaluate the activation of SURV and in vivo tumorigenesis experiments to explore the potential using this vector to treat lung cancer. Results: The vector pSURVTK has been successfully constructed which can not only express the TK protein indentified by Western Blotting， but also show its enzyme activation related to the concentration of ganciclovir and suppression of tumor growth in vivo. Conclusion: Survivin promoter can effectively drive the HSV1TK to express. The expression of TK gene will be confined just within the site of tumor. This presented a new way of employment sucide genes for treatment of lung cancer.

　　[Key words] lung cancer; gene therapy; survivin; promoter; herpes simplex virus 1 thymidine kinase

　　肺癌已成为恶性肿瘤死亡的首要病因，传统的治疗方法包括化疗、放疗和手术，总的生存率不到15 %[1]。随着免疫学和分子生物学的飞速发展，肺癌的基因治疗越来越受到研究人员的重视。采用非病毒载体携带治疗基因，如自杀基因单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1TK)基因是目前肺癌基因治疗的研究热点之一。这些非病毒载体一般使用真核细胞启动子如巨细胞病毒启动子(CMV promoter)，该启动子无组织特异性，在正常细胞中也能高表达TK基因，通过使无毒的前药如更昔洛韦(GCV)转化成有毒的磷酸化产物，对正常组织也会造成损伤[2，3]。所以，研究在肺癌细胞高表达，而在正常组织低表达，甚至不表达的特异性启动子是肺癌自杀基因治疗成功的关键。

　　生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins， IAP)家族的新成员，其组织分布特征具有明显的细胞选择性，在胚胎及多种肿瘤细胞系中高表达，但是不表达于终末分化的正常组织[4-6]。Survivin主要通过转录水平调控mRNA或蛋白的表达[7-8]。

　　本研究构建了生存素基因启动子(survivin promoter)调控的HSV1TK基因表达载体，通过体内外对肺癌细胞的杀伤效应研究，证实生存素启动子在肺癌细胞中特异性活化，可以驱动其调控的下游TK基因的表达，在更昔洛韦(Ganciclovir，GCV)的作用下，可有效抑制肺癌细胞的生长，为应用自杀基因治疗肺癌提供了新思路。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂和工具酶

　　异丙基β半乳糖苷(IPTG)、低分子质量蛋白标准品、核酸标准参照物、限制性内切酶Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、Nco Ⅰ、Xho Ⅰ和Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、质粒DNA纯化试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA标准参照物(上海华美生物工程公司);蛋白胨、酵母粉、丙烯酰胺等(上海生工生物工程公司);PCR引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。脂质体Lipofectamine2000 购于Invitrogen 公司，更昔洛韦购自罗氏公司，兔抗HSV1TK血清由耶鲁大学William C Summers教授馈赠。

　　1.2 质粒和细胞株、菌株

　　Survivin基因启动子SURV由美国MD Anderson Cancer Center的MienChie Hung教授馈赠，含有HSV1TK cDNA的质粒rpAs16Dr由德国MartinLuther大学Ariane Sling教授馈赠， pGL3Basic载体购自美国Promega公司，质粒pcDNA3.1(+)、人肺癌细胞株A549、E.coli菌株XL1Blue由本室保存。

　　1.3 仪 器

　　凝胶扫描仪、蛋白电泳仪、电转化仪、凝胶扫描仪、AKTA Prime 高压液相色谱仪(以上均为伯乐公司产品)，恒流泵(兰格公司)。

　　1.4 重组载体pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc的构建

　　根据HSV1TK的DNA序列设计一对引物，在P1和P2的5′ 端引Nco Ⅰ和Xho Ⅰ两个酶切位点，TKP1：5′ATCCATGGATGGCTTCGTACCCCT3′和TKP2：5′ATCTCGAGTCAGTTAGCCTCCCCC3′，将PCR产物亚克隆至用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ消化的真核表达质粒pGL3Luc，PCR鉴定阳性重组质粒pGL3TK;Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切pcDNA3.1(+)并回收CMV启动子，与SURV启动子一起克隆至pGL3Luc和pGL3TK的Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位点间，Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切鉴定重组载体pSURVTK、pCMVTK，并经DNA测序证实。

　　1.5 蛋白质印迹法检测转染细胞外源HSV1TK基因表达蛋白

　　人肺癌细胞系A549及正常人肝细胞LO2均用DMEM培养液于37 ℃、5%CO2条件下培养。转染前1天，取生长良好的细胞，胰酶消化，记数，将细胞浓度调至5×104个/ml，在6孔细胞培养板的每孔加入2 ml含上述细胞的DMEM培养液，每孔细胞数为1×105个。在Lipofectamine 2000的介导下分别转染pSURVTK质粒和pCMVTK质粒。每种质粒转染3个孔，具体按Lipofectamine 2000操作手册进行，待转染的细胞用无血清、无双抗的DMEM培养基洗2次，在每孔中加入混匀的DNA脂质体复合物溶液，细胞在37 ℃继续温育5 h后，吸去转染液，加入2 ml含10%小牛血清的DMEM，继续培养48 h。PBS充分洗涤细胞，100 ℃、10 min将细胞裂解，取15 μl细胞裂解液加15 μl 2×加载缓冲液，100 ℃、10 min，12 000×g离心10 min。取20 μl上清12% SDSPAGE电泳，阴性对照为未转染的A549、LO2细胞裂解物，电转移至硝酸纤维膜，加1∶200稀释的兔抗HSV1TK血清37 ℃轻摇孵育2 h，1×PBST(含0.05% Tween20)洗膜3次，加1∶200稀释的羊抗兔IgGHRP， 37 ℃轻摇孵育2 h，加邻苯二胺显色10 min，水洗终止反应。

　　1.6 MTT法测定细胞增殖抑制率

　　在96孔细胞培养板的每孔中加入0.1 ml含上述细胞的DMEM培养液，每孔细胞数为5×104个，用pSURVTK，pSURVLuc质粒DNA 在Lipofectamine 2000的介导下转染细胞，质粒的用量为0.1 μg/孔;脂质体Lipofectamine 2000的用量为0.2 μl/孔。每种质粒转染40个孔。转染48 h后，分别加入终浓度为0，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，100，150 μmol/L的GCV，其中不加GCV的3孔作为对照组，以上每份样品均设3个复孔。37 ℃继续培养3 d。采用MTT法测定细胞增殖情况。1000 r/min离心5 min，去上清，每孔加入MTT(5 mg/ml)10 μl，继续培养4 h，每孔加入100 μl二甲亚砜(DMSO)混匀，570 nm测D值，根据下列公式计算细胞增殖抑制率(GIR)：GIR(%)=(1-实验组光密度值/对照组光密度值)×100%。

　　1.7 pSURVTK抗肿瘤实验

　　将A549细胞悬浮于PBS中，浓度调至1×107个/ml。BALB/c 裸鼠，雌雄不限，4～6周龄，体质量30～60 g，随机分为3组，每组10只。分别于背部皮下注射100 μl细胞。当肿瘤体积达到30 mm3时，瘤内注射pSURVTK、pCMVTK、pCMVLuc 质粒DNA-脂质体复合物(50 μg/次)，每隔1天依次转染，连续7次，转染的第2次各组动物同时尾静脉注射GCV，100 mg /kg，共6次。每隔1天测量1次肿瘤体积，肿瘤体积(V)=A(mm)×B(mm)2/2。A为肿瘤最长直径，B为最短直径。

　　1.8 数据处理

　　数据均采用x±s形式表示，利用SAS 8.1软件对各实验组的细胞增殖抑制率与其对照组的差异显著性进行t检验分析。

　　2 结 果

　　2.1 真核表达载体pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc的构建

　　将制备好的TK基因PCR片段亚克隆至真核表达载体pGL3Luc中，筛得的阳性菌落经PCR扩增鉴定，经1%琼脂糖凝胶电泳，可见到与TK基因相对分子质量一致的目的基因片段(HSVTK相对分子质量为1144 bp左右)(图1A)，核苷酸序列测定结果表明，克隆基因的核苷酸序列与HSVTK的DNA序列完全一致，说明pGL3TK构建成功;将制备好的SURV、CMV启动子片段分别亚克隆至pGL3-Luc或pGL3TK真核表达载体Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ的酶切位点间，筛得的阳性菌落经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切，获得900 bp大小CMV启动子基因(图1B，泳道1)和977 bp大小SURV启动子基因(图1B，泳道2)，经核苷酸序列测定证实，pSURVTK、pCMVTK，pSURVLuc、pCMVLuc构建成功。图1 PCR扩增HSV1TK基因及pSURVTK、pCMVTK重组真核表达载体酶切鉴定

　　2.2 HSV1TK基因的表达

　　转染pSURVTK质粒或pCMVTK的质粒A549细胞裂解蛋白能被兔抗HSV1TK阳性血清特异性识别，且识别条带的浓度相近，而转染pSURVLuc质粒或pCMVLuc质粒的A549细胞以及转染pSURVTK transfected LO2细胞裂解蛋白则不能被识别(图2)，说明HSV1TK基因在SURV启动子调控下于肺癌细胞中特异性高效表达。

　　2.3 TK蛋白的酶活性

　　对转染pSURVTK质粒的A549细胞进行不同浓度(0.01～500 μmol/L)GCV的细胞毒实验，采用MTT法检测72 h时的细胞杀伤活性。A549细胞的生长呈明显的浓度依赖性，低浓度(0.1 μmol/L)GCV对其的抑制率在第3天达到了41%，且抑制率与GCV浓度及作用时间(数据未列出)呈正相关，而转染pSURVLuc质粒的A549细胞在同样浓度的GCV作用下生长几乎未受影响(图3)。t检验分析表明差异具统计学意义，由此表明SURV启动子调控下的HSV1TK基因仍具有很好的酶活性。

　　M：蛋白标准参照物;1：转染pSURVTK的A549 细胞;2：转染pCMVTK的A549细胞;3：转染pSURVLuc的 A549 细胞;4：转染pCMVLuc的 A549细胞;5：转染pSURVTK的LO2细胞图2 SURV启动子调控HSV1TK基因表达的蛋白印迹分析　图3 HSV1TK基因表达对肺癌细胞和正常细胞增殖的影响

　　2.4 HSV1TK基因对体内肿瘤生长的抑制作用

　　第6天肺癌瘤体长至38 mm3大小，这时3组大鼠分别瘤内注射pSURVTK、pCMVTK、pCMVLuc 质粒DNA脂质体复合物，接着尾静脉应用GCV，20 d后pSURVTK组和pCMVTK组肿瘤大小仅分别为85、83 mm3，而pCMVLuc组(对照载体)大小为180 mm3，P&<0.56，已有差异，26 d后P&<0.05，差异有统计学意义，而pSURVTK组和pCMVTK组肿瘤大小平均分别为94 mm3和87 mm3，差异无统计学意义(图4)。这说明SURV启动子调控下的HSV1TK基因能有效抑制肿瘤生长，SURV启动子在肺癌中的活性接近强启动子CMV的活性。

　　3 讨 论

　　自杀基因疗法的最大特征就是具有“旁观者效应”，即只要正常组织有少量目的基因获得表达，就有可能产生严重的副作用[9]。因此，使自杀基因仅在肺癌组织中获得特异性表达，从而准确地杀伤肿箭头处为给药时间点， *：P&<0.01，给药组与未给药组比较，n=10　　图4 体内转染pSURVTK对肿瘤生长的抑制作用瘤细胞，保护正常组织，减少毒副作用，是肺癌采用自杀基因疗法的关键。其中，用肿瘤特异性启动子启动目的基因特异性的表达是目前多数学者关注的方法之一[3]。

　　研究显示，SURV启动子在肿瘤细胞中具有高活性，正常细胞株和组织中被抑制，尤其是肺组织。SURV启动子在心、肺、脑、肝、肾活性很低，表明当体内应用SURV调控的TK基因载体时，毒副作用可以大大降低[10]。

　　常用的肿瘤特异性启动子如AFP、hTERT等启动子的活性往往弱于CMV启动子和SV40启动子，SURV启动子也不例外。我们的研究结果显示，虽然SURV在各种肿瘤细胞的活性仅为CMV启动子的10%～40%，已足够抑制肿瘤细胞的生长，一方面表明SVRV启动子在肺癌细胞中也具有很强的启动下游基因转录的活性，另外，特异性表达于肺癌细胞中的TK也产生显著的旁观者效应，极大地弥补了启动子活性低的不足。

　　我们构建了SURV启动子调控下的HSV1TK基因的真核表达载体pSURVTK，采用蛋白质印迹法证实pSURVTK在肺癌细胞系A549中可表达出TK蛋白，GCV细胞毒实验表明表达的TK蛋白具有酶活性，可有效抑制体内肺癌的生长。

　　综上所述，SURV启动子可以驱动TK基因在肺癌细胞中的特异性转录，在GCV作用下，体内外能有效杀伤肺癌的生长，为自杀基因治疗肺癌提供了新的途径。

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