克氏螯虾壳聚糖对实验性大鼠血脂水平及动脉粥样硬化形成的影响

【摘要】 目的： 探讨克氏螯虾壳聚糖对实验性高脂血症大鼠血脂水平及动脉粥样硬化形成的影响。方法： 将40只大鼠随机分为对照组，高脂模型组，克氏螯虾壳聚糖低、中、高剂量组，每组8只。实验至第9周末，检测血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoproteincholesterol，LDLc)、高密度脂蛋白(high density lipoproteincholesterol，HDLc)和丙二醛(malonaldehyde， MDA)的含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性。同时取主动脉作病理形态学观察。结果： 与高脂模型组比较，克氏螯虾壳聚糖组大鼠主动脉壁厚度明显降低，泡沫细胞数量明显减少;血清TC、TG、LDL 、MDA含量明显降低， HDL、SOD含量明显提高(P&<0.01)。结论： 克氏螯虾壳聚糖对实验性高脂血症大鼠有较好的降血脂、抗脂质过氧化损伤作用，可减缓大鼠动脉粥样硬化的形成。

【关键词】 克氏螯虾壳聚糖; 大鼠; 血脂; 抗氧化; 动脉粥样硬化

[Abstract] Objective: To investigate the action of the Crayfish chitosan on blood lipids and atherogenesis in the experimental hyperlipidemia rats. Methods: Forty rats were randomly pided into control group， high fat model group， low dose Crayfish chitosan group ， medium dose Crayfish chitosan group and high dose Crayfish chitosan group， every group had eight rats. By the ninth weekend， the serum cholesterol (TC)， triglyceride (TG)， low density lipoprotein cholesterol (LDLc)， high density lipoproteincholesterol(HDLc) ， MDA and superoxide dismutase (SOD) activity were determined. The aorta pathomorphism was observed. Results: Compared with the fat model group， the aortic wall thickness was decreased and foam cells reduced significantly in Crayfish chitosan group. The contents of serum TC， TG， LDLc， MDA decreased significantly and HDLc， SOD was increased significantly (P&<0.01) in Crayfish chitosan group. Conclusion: Crayfish chitosan can increase blood lipid antioxidation and reduce the atherosclerosis formation in the experimental hyperlipidemia rats.

　　[Key words] Crayfish chitosan; rats; blood lipid; antioxidant; atherosclerosis

　　克氏螯虾壳聚糖(Crayfish chitosan)是本课题组从克氏螯虾的外壳中提取、制备的一种碱性氨基多糖，是自然界唯一带有阳离子的可食用碱性多糖[1] 。研究表明克氏螯虾壳聚糖具有抗菌[2]、降血糖[3]等作用，但对调血脂抗氧化，预防动脉粥样硬化方面的研究尚未见报道。本文通过对实验性高脂血症模型大鼠的研究，探讨克氏螯虾壳聚糖调血脂抗氧化，预防动脉粥样硬化形成的作用，为克氏螯虾壳聚糖的临床应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　日本岛津CL7300型全自动生化分析仪，日本Olympus显微镜。克氏螯虾壳聚糖，由镇江科力生物技术有限公司制备;胆固醇，上海伯奥生物科技有限公司产品;维生素D，上海通用药业股份有限公司产品;胆酸钠片，温州生物化学制药厂;丙硫氧嘧啶片，上海复星药业有限公司;总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoproteincholesterol，LDLc)、高密度脂蛋白(high density lipoproteincholesterol，HDLc)检测试剂盒，由北京中生北控生物科技股份有限公司生产;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

　　1.2 动物与饲料

　　SD大鼠，雄性，40只，体质量180～205 g，由江苏大学实验动物中心提供。基础饲料由江苏大学实验动物中心提供。高脂饲料，用81.3%基础饲料、10%猪油、3%胆固醇、0.5%胆酸钠、5%白糖、0.2%丙硫氧嘧啶配制而成。

　　1.3 方 法

　　1.3.1 动物分组与造模

　　用基础饲料适应性喂养SD大鼠5 d后，随机分为5组：正常对照组，高脂模型组， 克氏螯虾壳聚糖低、中、高剂量组，每组8只。对照组每日以基础饲料喂养，给等量0.9%氯化钠溶液灌胃;高脂模型组以40 ml/kg剂量一次性腹腔注射维生素D后，每日以高脂饲料喂养，给等量0.9%氯化钠溶液灌胃[4];克氏螯虾壳聚糖低、中、高剂量组自造模日起给高脂饲料的同时分别用克氏螯虾壳聚糖300，600，900 mg/kg灌胃，1次/d。

　　1.3.2 生化指标检测

　　实验9周后禁食不禁水12 h，麻醉后眼眶后静脉丛采血，分离血清。严格按照试剂盒说明书，分别以校准血清进行仪器校准，再进行室内质控血清测定，质控结果在允许范围内，分别对血清TG、TC、HDLc、LDLc、SOD和MDA进行测定。

　　1.3.3 大鼠主动脉病理形态观察

　　采完血后取主动脉约1 cm，用10%甲醛溶液固定。逐级乙醇脱水，石蜡包埋切片，苏木精伊红(HE)染色，显微镜下观察大鼠主动脉病理形态的变化。

　　1.4 统计学方法

　　数据以均数±标准差(x±s)表示，用Stata 7.0软件进行单因素方差分析，P&<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 克氏螯虾壳聚糖对大鼠主动脉病理形态的影响

　　正常对照组大鼠血管内膜表面光滑而连续完整，未见细胞黏附，内膜下间隙较窄，中膜平滑肌细胞排列规整，无增生;高脂模型组大鼠血管壁增厚，内膜粗糙，内皮细胞呈连续性缺失，底层的胶原纤维显露，大量单核细胞黏附于内皮表面或潜入内皮下，内皮下间隙增宽，内弹力板分离断裂;克氏螯虾壳聚糖组大鼠血管内膜光滑，低、中剂量组大鼠血管内膜局部仅有少量单核细胞黏附，偶见内皮细胞缺失，平滑肌细胞增生，但明显好于模型组，高剂量组大鼠血管内膜与正常对照组相似，几乎看不出区别。

　　2.2 克氏螯虾壳聚糖对大鼠血脂水平的影响

　　给高脂饲料后，高脂模型组大鼠血清TC、TG、LDLc含量显著升高，HDLc含量显著降低，与正常对照组相比，差异均有统计学意义(P&<0.01)，表明高脂模型造模成功。给予克氏螯虾壳聚糖后，各剂量组TC、TG、LDLc含量均降低，HDLc含量均升高，中、高剂量组与高脂模型组比较，差异有统计学意义(P&<0.01) ;低剂量组的LDLc含量与高脂模型组比较，差异也有统计学意义(P&<0.05)。见表1。　　表1 各组大鼠血清TC、TG、HDLc及LDLc含量比较

　　2.3 克氏螯虾壳聚糖对大鼠血清SOD及MDA含量的影响

　　与正常对照组比较，高脂模型组大鼠血清SOD含量显著下降(P&<0.01)，MDA则显著升高(P&<0.01)，给予克氏螯虾壳聚糖，各剂量组SOD均升高，与高脂模型组比较差异有统计学意义(低、中剂量组P&<0.05，高剂量组P&<0.01);壳聚糖各剂量组MDA含量有所下降，与高脂模型组比较，差异均有统计学意义(P&<0.05)，见表2。表2 各组大鼠血清SOD及MDA含量比较

　　3 讨 论

　　动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是指动脉内膜的脂质、血液成分的沉积，平滑肌细胞及胶原纤维增生，伴有坏死及钙化等不同程度病变的一类慢性进行性病理过程。AS的发展是多因素综合作用的复杂过程，大多公认的机制是：① 氧化型低密度脂蛋白胆固醇(oxLDL)损伤内皮细胞功能，释放炎性因子和细胞因子;② 巨噬细胞吞噬oxLDL形成泡沫细胞与胆固醇结晶构成脂质核心;③ 血管中膜的平滑肌细胞迁移至内膜转化成分泌型的平滑肌细胞并增殖，分泌更多的结缔组织基质致斑块纤维性增厚：④ 斑块破裂组织因子显露，启动血小板聚集和纤维蛋白形成，导致血栓的形成[5]。血管壁内膜中层厚度增厚是AS的早期指征[6]，本实验高脂模型组大鼠血管壁增厚，内膜粗糙，内皮细胞呈连续性缺失，底层的胶原纤维显露，大量单核细胞黏附于内皮表面或潜入内皮下，内皮下间隙增宽，内弹力板分离断裂，说明在注射维生素D后再进行高脂饲料喂食9周可导致大鼠AS形成。

　　大量资料表明，高脂血症是AS的主要危险因素。血浆中过高水平的TG、TC及相应的LDLc能促进AS的形成，并与AS的病程发展呈正相关;而HDLc与AS的病程发展则呈负相关。本实验结果显示，高脂模型组大鼠与对照组比较，血浆中TG、TC及相应的LDLc水平均显著增高，HDLc含量显著降低;可能是高浓度LDLc渗进动脉内皮下，被动脉壁中内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞产生的氧自由基所氧化修饰，形成oxLDL，促进了AS形成。由实验可知，在造模同时给予克氏螯虾壳聚糖可显著降低实验大鼠的血浆TG、TC及LDLc水平，增加HDLc的水平，表明克氏螯虾壳聚糖能调节脂代谢紊乱，减轻其对动脉内膜的毒性和损害作用。另外，机体脂质过氧化生成的自由基和过氧化氢还可共同损伤血管内膜，使血中TC、TG易沉积于血管壁，促进LDL的氧化修饰及单核细胞向泡沫细胞转变，从而使血管壁增厚，导致AS[7]，而SOD作为抗氧化剂，其活性的高低反映了机体清除氧自由基的能力，它对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。因此，通过检测大鼠体内的脂质过氧化代谢产物MDA可间接了解自由基对组织细胞的损伤程度，测定血清SOD活性可了解其对体内氧化自由基的清除能力。本实验结果显示，克氏螯虾壳聚糖可降低高脂模型组大鼠MDA水平，升高SOD活性，即表明克氏螯虾壳聚糖具有较强的抗脂质过氧化损伤的作用。

参考文献

　[1] 郑铁生，辛淮生，卞爱民，等.地产龙虾壳甲壳素的提取和壳聚糖的制备[J]. 时珍国医国药， 2005， 16(12): 1208-1209.

　　[2] 郑铁生，王亚娜，宗爱萍.壳聚糖天然抗菌的活性及其稳定性[J]. 商场现代化， 2005， 6(435): 188-189.

　　[3] 郑铁生，王亚娜，宗爱萍.龙虾壳聚糖干预后糖尿病小鼠血糖和糖耐量的变化[J]. 中国临床康复，2006，(31)：67-69.

　　[4] 袁菊萍，黄金华，陆 媛.壳聚糖抗动脉粥样硬化的实验研究[J]. 医药导报，2009，28(6): 698-699.

　　[5] 郑铁生，鄢盛恺.临床生物化学检验[M].2版.北京：中国医药科技出版社，2010：295.

　　[6] 杨 玲，陈军建，王 东，等.糖耐量减退患者餐后三酰甘油与动脉粥样硬化的相关性[J]. 江苏大学学报：医学版，2009，19(1): 27-30.

　　[7] 王怡练， 孙黎明， 王正忠，等.冠心病伴脑梗死患者血清同型半胱氨酸水平及颈动脉粥样硬化程度的相关性[J]. 江苏大学学报：医学版，2009，19(3): 262-264.