作者:祁卫东 蒋鹏程 张恒 马圭 范钰
【摘要】 目的: 探讨中期因子(midkine,MK)基因小干扰RNA对胃癌细胞生物学行为的影响。方法: 培养人胃癌BGC823、HGC27、MGC803及SGC7901细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测中期因子基因mRNA表达;筛选出中期因子表达最高者。采用中期因子基因小干扰RNA转染胃癌细胞株,分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法观察中期因子基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Boyden方法检测癌细胞侵袭力。结果: 4株胃癌细胞中,中期因子均有不同程度的表达,以胃癌BGC823细胞最高;以MK siRNA转染胃癌BGC823细胞后,癌细胞中期因子基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;转染组细胞黏附数量明显下降,细胞侵袭力明显下降。结论: 中期因子基因在胃癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染胃癌细胞,可抑制胃癌细胞黏附和侵袭能力。
【关键词】 胃癌; 中期因子; RNA干扰; 黏附; 侵袭
[Abstract] Objective: To study the effects of midkine(MK) gene small interfering RNA(siRNA)on adhesion and invasion of human gastric cancer cell. Methods: Real time PCR was used to evaluate the MK mRNA expression of human gastric cancer cell lines BGC823,HGC27,MGC803 and SGC7901.The cell of MK highest expression was transfected with different dose of MK siRNA. The expression of MK mRNA and proteinwere were determined by realtime quantitative PCR and immumoflurescence method.The cell adhesion was evaluated by MTT assay, and invasion was exmined by Boyden chamber,respectively. Results: Cell line BGC823 showed the highest elevation of MK mRNA in four gastric cancer cell lines. The results from realtime quantitative PCR and immumoflurescence method showed that MK mRNA and protein reduced in timeand dosedependent manners(P&<0.01;P&<0.01).The adhesive, and invasive ability of BGC823 cell treated with MK siRNA decreased compared with control groups(P&<0.01, P&<0.01). Conclusion: MK gene might play an important role in adhesion and invasion of human gastric cancer cell. siRNA targeted MK could effectively inhibit adhesion,migration,and invasion of human gastric cancer cell.
[Key words] gastric carcinoma; midkine; RNA interference; adhesion; invasion
尽管胃癌的诊断和治疗已经有了长足的进步,但进展期胃癌的预后依然很差,5年生存率徘徊在20%~30%。己经证实,胃癌的发生发展是多基因改变的结果。胃癌中特殊基因的表达异常在不同的细胞功能中发挥了重要作用,如细胞黏附、信号传导、细胞分化、细胞增殖及转移。更好地了解胃癌发生发展的分子机制将有利于胃癌的诊治及预防。
许多研究表明生长因子不仅促进组织细胞的增殖,而且能诱导组织细胞的恶性转化,在肿瘤的发展中发挥了重要的角色。中期因子(midkine,MK)基因是1988年Muramatsu等[1]在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM1细胞cDNA文库中发现的一种新基因,其后,在多种动物和人类中均已发现了中期因子基因。中期因子和另一种相似的细胞因子——多效生长因子(pleiotrophin,PTN)一起归为一类新的肝素结合因子家族(heparin binding factor family)[1]。研究发现,中期因子在许多肿瘤如食管癌、结肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、肺癌等多种癌细胞和组织中过表达,而在正常组织中表达很低或不表达[2-7]。因此,中期因子有可能作为肿瘤标志物在肿瘤的诊断、预后和治疗中发挥作用。目前,关于中期因子与胃癌的关系研究较少。
本研究以胃癌细胞为模型,以小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术下调癌细胞中期因子表达,旨在探讨中期因子基因在人胃癌细胞黏附、侵袭中的可能作用。
1 材料和方法
1.1 材 料
人胃癌BGC823、HGC27、MGC803及SGC7901细胞株,由本院组织细胞生物库冻存。MK siRNA正义链序列:5′AGGACUAGACGCCAAGCCUTT3′,由美国Dharmacon公司合成。RPMI 1640购自Gibco公司;Trizol、实时PCR扩增试剂盒和脂质体转染试剂LipofectamineTM2000及逆转录试剂盒购自Invitrogen公司;鼠抗人MK及β肌动蛋白抗体购自Santa Cruz公司;MTT购自Sigma公司;基膜基质Matrigel购自Becton Dickinson公司。
1.2 方 法
1.2.1 细胞培养
胃癌细胞在含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RBMI 1640培养液,37 ℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。待对数生长期时,收取细胞,进行以下试验。
1.2.2 胃癌细胞MK mRNA检测
采用荧光实时定量RTPCR方法检测中期因子mRNA。
1.2.2.1 细胞总RNA提取及cDNA合成
根据说明书,分别采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA,采用逆转录试剂盒合成cDNA。
1.2.2.2 定量RT
PCR 采用荧光实时定量PCR检测。收集细胞,以Trizol抽提细胞总RNA,取总RNA 1μg,以Oligo dT(15 mer)为引物逆转录合成cDNA第一链,以此cDNA链2 μl为模板进行PCR扩增,步骤参照逆转录试剂盒说明书进行。引物序列上游:5′GCGCGCTACAATGCTCAGT3′,下游:5′CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT3′。FAM探针:5′CATGGGTGCCCCGACGTTGC3′TAMRA。PCR反应条件:95 ℃,预变性3 min,95 ℃30 s,52 ℃45 s,72 ℃45 s;35个循环后,72 ℃再延伸7 min。反应后生成熔解曲线。MK基因表达值以2-ΔΔCt表示[8]。
1.2.3 siRNA转染
借助于LipofectamineTM2000进行转染,具体操作参照说明书进行。转染前1d,将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板,1 ml/孔,培养过夜。次日进行转染。细胞分组:① 空白对照组(ConA):未经任何处理的胃癌细胞;② 空载对照组(ConB):即脂质体对照组;③ 错配对照组(ConC);④ siRNA组:10%FBS的RPMI 1640中含不同浓度的已用脂质体包埋的siRNA。
1.2.4 转染后中期因子基因mRNA及蛋白水平检测
1.2.4.1 mRNA水平
采用荧光实时定量RT-PCR方法检测,方法同上。
1.2.4.2 蛋白水平
采用免疫荧光法检测。将胃癌细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中,细胞和盖玻片表面完全吸附后,用PBS洗2次,丙酮固定。PBS振洗后吹干。滴加MK单克隆抗体(1∶1000)覆盖整个切片,4 ℃过夜。PBS振洗3次后吹干。滴加1∶50稀释的FITC标记的二抗,37 ℃保温30 min。PBS振洗2次后用蒸馏水振洗。50%缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察,拍照,荧光强度扫描。
1.2.5 胃癌细胞黏附力检测
参照文献[8]方法进行,部分步骤有改动。96孔培养板的每个孔铺以50 μl基质胶(1∶20稀释),然后每孔加入含10 mg/ml小牛血清白蛋白的无血清RPMI1640培养液50 μl,作用1 h。每孔加入2×104的悬浮细胞,放入CO2培养箱中。作用1 h后,没有黏附到培养板上的细胞被洗掉,已经黏附的细胞被胰酶消化,然后计细胞数。黏附力=siRNA组细胞黏附数/ConA细胞黏附数×100%。
1.2.6 采用Boyden小室模型检测癌细胞侵袭能力
Boyden小室上下室之间铺聚碳酸醋微孔滤膜(孔径8 μm),滤膜上包被有Matrigel。用无血清培养基准备单细胞悬液,并调整浓度为2.5×104/ml。细胞以500 μl无血清培养基重悬,接种于培养小室的上层,小室下层加入500 μl含 10%FBS的培养基作为趋化物。在37 ℃,5%CO2,饱和湿度条件下分别培养72 h后,用棉拭子去除上室底部基质胶并移除未侵袭细胞;接着固定30 min,PBS漂洗2次;HE染色30 min。随机选择5个100倍显微视野统计总细胞数,以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。每组设3个平行样本,取其平均值,进行统计学分析。
1.2.7 统计学分析
数据资料以x±s表示,以SPSS 10.0统计软件分析。用Levene法进行方差齐性检验。若方差齐,用单因素方差分析,组间及组内比较用LSDt检验;若方差不齐,用GamesHowell法进行分析。
2 结 果
2.1 胃癌细胞株中期因子基因mRNA表达水平
荧光定量PCR结果显示熔解曲线具有单峰特异性。见图1。荧光实时定量RTPCR结果显示,MK mRNA在MGC803、SGC7901、HGC27及BGC823分别为0.003±0.000、0.678±0.202、0.936±0.251、1.753±0.244。BGC823细胞株中MK mRNA水平最高。故后续试验以BGC823细胞为模型。图1 中期因子基因熔解曲线
2.2 siRNA转染对胃癌BGC
823细胞MK基因mRNA和蛋白水平的影响定量PCR和免疫荧光结果显示,siRNA转染组细胞中期因子mRNA以及蛋白水平明显下降,且呈浓度和时间依赖性(P&<0.01,P&<0.01)。见图2,图3。图2 siRNA转染对胃癌BGC823细胞中期因子基因mRNA的影响 图3 siRNA转染对胃癌BGC823细胞中期因子水平的影响
2.3 中期因子基因siRNA转染对胃癌细胞黏附力的影响
结果显示,与ConA对照组比较,MK siRNA转染组细胞黏附明显受到抑制,且呈浓度依赖性(P&<0.01),而脂质体对照组(ConB)无明显变化。见图4。图4 中期因子基因siRNA转染对胃癌BGC823细胞黏附力的影响
2.4 siRNA转染对BGC823细胞侵袭能力的影响
Boyden小室上室细胞穿过膜上Matrigel到膜的下室面,其数量反映了细胞侵袭能力的大小。Boyden小室结果显示,与对照组比较,MK siRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降,且呈浓度依赖性(P&<0.01)。见图5。图5 中期因子siRNA转染对胃癌细胞侵袭力的影响
3 讨 论
中期因子是肝素结合生长因子家族的成员。人中期因子基因定位于11p11.2,由5个外显子和4个内含子组成。其启动子区域有视黄酸反应元件,因此视黄酸可诱导胚胎瘤细胞系和某些组织中期因子的表达。成熟的中期因子是一种分泌性蛋白,在妊娠中期胎儿组织中分布广泛,出生后表达水平降低。在正常成人组织中,中期因子在小肠黏膜高表达,在甲状腺中度表达,在肺、结肠、胃、肾及脾组织中微弱表达,而在肝脏完全不表达。
近年来研究发现,中期因子高表达于多种人类恶性肿瘤,如乳腺癌、食管癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、神经母细胞瘤和Wilm′s瘤等。本研究采用荧光实时定量PCR方法检测4株胃癌细胞中期因子基因表达,发现BGC823细胞中期因子表达最高。进一步以BGC823细胞为模型,采用中期因子基因siRNA转染该细胞后,分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法检测,结果显示,转染组胃癌细胞MK mRNA和蛋白水平明显下调,且呈时间和浓度依赖性。
癌的侵袭与转移是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程。其中细胞黏附和侵袭是关键步骤。本实验通过RNA干扰技术下调胃癌BGC823细胞中中期因子基因表达,并观察癌细胞黏附和侵袭力的变化。结果显示,中期因子基因表达下调后,癌细胞黏附和侵袭力明显下调,且呈浓度依赖性。
本研究结果提示,中期因子基因在人胃癌细胞黏附、侵袭中发挥着重要的作用,以该基因为靶点开展胃癌的靶向治疗,将会有助于胃癌的综合治疗。
参考文献
[1] Kadomatsu K,Tomomura M,Muramatsu T. cDNA cloning and sequencing of a new gene intensely expressed in early differentiation stages of embryonal carcinoma cells and in midgestation period of mouse embryogenesis[J]. Biochem Biophys Res Commun,1988,151(3): 1312-1318.
[2] Tanabe K, Matsumoto M, Ikematsu S, et al. Midkine and its clinical significance in endometrial carcinoma[J]. Cancer Sci,2008,99(6):1125-1130.
[3] Maeda S, Shinchi H, Kurahara H,et al. Clinical significance of midkine expression in pancreatic head carcinoma[J]. Br J Cancer,2007,97(3):405-411.
[4] Ibusuki M, Fujimori H, Yamamoto Y,et al. Midkine in plasma as a novel breast cancer marker[J]. Cancer Sci,2009,100(9):1735-1739.
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