RNAi沉默中期因子基因表达对胃癌细胞黏附和侵袭力的影响

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论文字数:**** 论文编号:lw2023118381 日期:2025-10-16 来源:论文网

     作者:祁卫东 蒋鹏程 张恒 马圭 范钰

【摘要】 目的: 探讨中期因子(midkine,MK)基因小干扰RNA对胃癌细胞生物学行为的影响。方法: 培养人胃癌BGC823、HGC27、MGC803及SGC7901细胞株,以荧光实时定量PCR方法检测中期因子基因mRNA表达;筛选出中期因子表达最高者。采用中期因子基因小干扰RNA转染胃癌细胞株,分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法观察中期因子基因mRNA和蛋白水平,然后以四唑蓝(MTT)比色法检测细胞黏附性,以Boyden方法检测癌细胞侵袭力。结果: 4株胃癌细胞中,中期因子均有不同程度的表达,以胃癌BGC823细胞最高;以MK siRNA转染胃癌BGC823细胞后,癌细胞中期因子基因mRNA和蛋白水平明显下降,且呈浓度依赖性;转染组细胞黏附数量明显下降,细胞侵袭力明显下降。结论: 中期因子基因在胃癌细胞黏附和侵袭中发挥着重要作用;以siRNA转染胃癌细胞,可抑制胃癌细胞黏附和侵袭能力。

【关键词】 胃癌; 中期因子; RNA干扰; 黏附; 侵袭

 [Abstract] Objective: To study the effects of midkine(MK) gene small interfering RNA(siRNA)on adhesion and invasion of human gastric cancer cell. Methods: Real time PCR was used to evaluate the MK mRNA expression of human gastric cancer cell lines BGC823,HGC27,MGC803 and SGC7901.The cell of MK highest expression was transfected with different dose of MK siRNA. The expression of MK mRNA and proteinwere were determined by realtime quantitative PCR and immumoflurescence method.The cell adhesion was evaluated by MTT assay, and invasion was exmined by Boyden chamber,respectively. Results: Cell line BGC823 showed the highest elevation of MK mRNA in four gastric cancer cell lines. The results from realtime quantitative PCR and immumoflurescence method showed that MK mRNA and protein reduced in timeand dosedependent manners(P&<0.01;P&<0.01).The adhesive, and invasive ability of BGC823 cell treated with MK siRNA decreased compared with control groups(P&<0.01, P&<0.01). Conclusion: MK gene might play an important role in adhesion and invasion of human gastric cancer cell. siRNA targeted MK could effectively inhibit adhesion,migration,and invasion of human gastric cancer cell.

  [Key words] gastric carcinoma; midkine; RNA interference; adhesion; invasion

  尽管胃癌的诊断和治疗已经有了长足的进步,但进展期胃癌的预后依然很差,5年生存率徘徊在20%~30%。己经证实,胃癌的发生发展是多基因改变的结果。胃癌中特殊基因的表达异常在不同的细胞功能中发挥了重要作用,如细胞黏附、信号传导、细胞分化、细胞增殖及转移。更好地了解胃癌发生发展的分子机制将有利于胃癌的诊治及预防。

  许多研究表明生长因子不仅促进组织细胞的增殖,而且能诱导组织细胞的恶性转化,在肿瘤的发展中发挥了重要的角色。中期因子(midkine,MK)基因是1988年Muramatsu等[1]在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM1细胞cDNA文库中发现的一种新基因,其后,在多种动物和人类中均已发现了中期因子基因。中期因子和另一种相似的细胞因子——多效生长因子(pleiotrophin,PTN)一起归为一类新的肝素结合因子家族(heparin binding factor family)[1]。研究发现,中期因子在许多肿瘤如食管癌、结肠癌、胰腺癌、肝细胞癌、肺癌等多种癌细胞和组织中过表达,而在正常组织中表达很低或不表达[2-7]。因此,中期因子有可能作为肿瘤标志物在肿瘤的诊断、预后和治疗中发挥作用。目前,关于中期因子与胃癌的关系研究较少。

  本研究以胃癌细胞为模型,以小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术下调癌细胞中期因子表达,旨在探讨中期因子基因在人胃癌细胞黏附、侵袭中的可能作用。

  1 材料和方法

  1.1 材 料

  人胃癌BGC823、HGC27、MGC803及SGC7901细胞株,由本院组织细胞生物库冻存。MK siRNA正义链序列:5′AGGACUAGACGCCAAGCCUTT3′,由美国Dharmacon公司合成。RPMI 1640购自Gibco公司;Trizol、实时PCR扩增试剂盒和脂质体转染试剂LipofectamineTM2000及逆转录试剂盒购自Invitrogen公司;鼠抗人MK及β肌动蛋白抗体购自Santa Cruz公司;MTT购自Sigma公司;基膜基质Matrigel购自Becton Dickinson公司。

  1.2 方 法

  1.2.1 细胞培养

  胃癌细胞在含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RBMI 1640培养液,37 ℃、5%CO2、饱和湿度环境的条件下连续培养。待对数生长期时,收取细胞,进行以下试验。

  1.2.2 胃癌细胞MK mRNA检测

  采用荧光实时定量RTPCR方法检测中期因子mRNA。

  1.2.2.1 细胞总RNA提取及cDNA合成

  根据说明书,分别采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA,采用逆转录试剂盒合成cDNA。

  1.2.2.2 定量RT

  PCR 采用荧光实时定量PCR检测。收集细胞,以Trizol抽提细胞总RNA,取总RNA 1μg,以Oligo dT(15 mer)为引物逆转录合成cDNA第一链,以此cDNA链2 μl为模板进行PCR扩增,步骤参照逆转录试剂盒说明书进行。引物序列上游:5′GCGCGCTACAATGCTCAGT3′,下游:5′CCCTTCCCTTTCTTGGCTTT3′。FAM探针:5′CATGGGTGCCCCGACGTTGC3′TAMRA。PCR反应条件:95 ℃,预变性3 min,95 ℃30 s,52 ℃45 s,72 ℃45 s;35个循环后,72 ℃再延伸7 min。反应后生成熔解曲线。MK基因表达值以2-ΔΔCt表示[8]。

  1.2.3 siRNA转染

  借助于LipofectamineTM2000进行转染,具体操作参照说明书进行。转染前1d,将1.0×105对数期生长的细胞接种于24孔培养板,1 ml/孔,培养过夜。次日进行转染。细胞分组:① 空白对照组(ConA):未经任何处理的胃癌细胞;② 空载对照组(ConB):即脂质体对照组;③ 错配对照组(ConC);④ siRNA组:10%FBS的RPMI 1640中含不同浓度的已用脂质体包埋的siRNA。

  1.2.4 转染后中期因子基因mRNA及蛋白水平检测

  1.2.4.1 mRNA水平

  采用荧光实时定量RT-PCR方法检测,方法同上。

  1.2.4.2 蛋白水平

  采用免疫荧光法检测。将胃癌细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中,细胞和盖玻片表面完全吸附后,用PBS洗2次,丙酮固定。PBS振洗后吹干。滴加MK单克隆抗体(1∶1000)覆盖整个切片,4 ℃过夜。PBS振洗3次后吹干。滴加1∶50稀释的FITC标记的二抗,37 ℃保温30 min。PBS振洗2次后用蒸馏水振洗。50%缓冲甘油封片。在荧光显微镜下观察,拍照,荧光强度扫描。

  1.2.5 胃癌细胞黏附力检测

  参照文献[8]方法进行,部分步骤有改动。96孔培养板的每个孔铺以50 μl基质胶(1∶20稀释),然后每孔加入含10 mg/ml小牛血清白蛋白的无血清RPMI1640培养液50 μl,作用1 h。每孔加入2×104的悬浮细胞,放入CO2培养箱中。作用1 h后,没有黏附到培养板上的细胞被洗掉,已经黏附的细胞被胰酶消化,然后计细胞数。黏附力=siRNA组细胞黏附数/ConA细胞黏附数×100%。

  1.2.6 采用Boyden小室模型检测癌细胞侵袭能力

  Boyden小室上下室之间铺聚碳酸醋微孔滤膜(孔径8 μm),滤膜上包被有Matrigel。用无血清培养基准备单细胞悬液,并调整浓度为2.5×104/ml。细胞以500 μl无血清培养基重悬,接种于培养小室的上层,小室下层加入500 μl含 10%FBS的培养基作为趋化物。在37 ℃,5%CO2,饱和湿度条件下分别培养72 h后,用棉拭子去除上室底部基质胶并移除未侵袭细胞;接着固定30 min,PBS漂洗2次;HE染色30 min。随机选择5个100倍显微视野统计总细胞数,以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。每组设3个平行样本,取其平均值,进行统计学分析。

  1.2.7 统计学分析

  数据资料以x±s表示,以SPSS 10.0统计软件分析。用Levene法进行方差齐性检验。若方差齐,用单因素方差分析,组间及组内比较用LSDt检验;若方差不齐,用GamesHowell法进行分析。

  2 结 果

  2.1 胃癌细胞株中期因子基因mRNA表达水平

  荧光定量PCR结果显示熔解曲线具有单峰特异性。见图1。荧光实时定量RTPCR结果显示,MK mRNA在MGC803、SGC7901、HGC27及BGC823分别为0.003±0.000、0.678±0.202、0.936±0.251、1.753±0.244。BGC823细胞株中MK mRNA水平最高。故后续试验以BGC823细胞为模型。图1 中期因子基因熔解曲线

  2.2 siRNA转染对胃癌BGC

  823细胞MK基因mRNA和蛋白水平的影响定量PCR和免疫荧光结果显示,siRNA转染组细胞中期因子mRNA以及蛋白水平明显下降,且呈浓度和时间依赖性(P&<0.01,P&<0.01)。见图2,图3。图2 siRNA转染对胃癌BGC823细胞中期因子基因mRNA的影响 图3 siRNA转染对胃癌BGC823细胞中期因子水平的影响

  2.3 中期因子基因siRNA转染对胃癌细胞黏附力的影响

  结果显示,与ConA对照组比较,MK siRNA转染组细胞黏附明显受到抑制,且呈浓度依赖性(P&<0.01),而脂质体对照组(ConB)无明显变化。见图4。图4 中期因子基因siRNA转染对胃癌BGC823细胞黏附力的影响

  2.4 siRNA转染对BGC823细胞侵袭能力的影响

  Boyden小室上室细胞穿过膜上Matrigel到膜的下室面,其数量反映了细胞侵袭能力的大小。Boyden小室结果显示,与对照组比较,MK siRNA组穿过滤膜的细胞数明显下降,且呈浓度依赖性(P&<0.01)。见图5。图5 中期因子siRNA转染对胃癌细胞侵袭力的影响

  3 讨 论

  中期因子是肝素结合生长因子家族的成员。人中期因子基因定位于11p11.2,由5个外显子和4个内含子组成。其启动子区域有视黄酸反应元件,因此视黄酸可诱导胚胎瘤细胞系和某些组织中期因子的表达。成熟的中期因子是一种分泌性蛋白,在妊娠中期胎儿组织中分布广泛,出生后表达水平降低。在正常成人组织中,中期因子在小肠黏膜高表达,在甲状腺中度表达,在肺、结肠、胃、肾及脾组织中微弱表达,而在肝脏完全不表达。

  近年来研究发现,中期因子高表达于多种人类恶性肿瘤,如乳腺癌、食管癌、结直肠癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、神经母细胞瘤和Wilm′s瘤等。本研究采用荧光实时定量PCR方法检测4株胃癌细胞中期因子基因表达,发现BGC823细胞中期因子表达最高。进一步以BGC823细胞为模型,采用中期因子基因siRNA转染该细胞后,分别以荧光实时定量PCR和免疫荧光方法检测,结果显示,转染组胃癌细胞MK mRNA和蛋白水平明显下调,且呈时间和浓度依赖性。

  癌的侵袭与转移是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程。其中细胞黏附和侵袭是关键步骤。本实验通过RNA干扰技术下调胃癌BGC823细胞中中期因子基因表达,并观察癌细胞黏附和侵袭力的变化。结果显示,中期因子基因表达下调后,癌细胞黏附和侵袭力明显下调,且呈浓度依赖性。

  本研究结果提示,中期因子基因在人胃癌细胞黏附、侵袭中发挥着重要的作用,以该基因为靶点开展胃癌的靶向治疗,将会有助于胃癌的综合治疗。

参考文献


 [1] Kadomatsu K,Tomomura M,Muramatsu T. cDNA cloning and sequencing of a new gene intensely expressed in early differentiation stages of embryonal carcinoma cells and in midgestation period of mouse embryogenesis[J]. Biochem Biophys Res Commun,1988,151(3): 1312-1318.

  [2] Tanabe K, Matsumoto M, Ikematsu S, et al. Midkine and its clinical significance in endometrial carcinoma[J]. Cancer Sci,2008,99(6):1125-1130.

  [3] Maeda S, Shinchi H, Kurahara H,et al. Clinical significance of midkine expression in pancreatic head carcinoma[J]. Br J Cancer,2007,97(3):405-411.

  [4] Ibusuki M, Fujimori H, Yamamoto Y,et al. Midkine in plasma as a novel breast cancer marker[J]. Cancer Sci,2009,100(9):1735-1739.

  [5] KrzystekKorpacka M, Matusiewicz M, Diakowska D, et al. Even a mild anemia is related to tumor aggressiveness mediated by angiogenic factors[J]. Exp Oncol,2009,31(1):52-56.

  [6] KrzystekKorpacka M, Matusiewicz M, Diakowska D,et al. Serum midkine depends on lymph node involvement and correlates with circulating VEGFC in oesophageal squamous cell carcinoma[J].Biomarkers,2007,12(4):403-413.

  [7] Trojan L, Schaaf A, Steidler A, et al. Identification of metastasisassociated genes in prostate cancer by genetic profiling of human prostate cancer cell lines[J]. Anticancer Res,2005,25(1A):183-191.

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