苦胆草对斯氏狸殖吸虫致大鼠肝纤维化中TIMP1表达的影响

　　　　　　 作者：屈朝霞， 马朝东， 王文林

【摘要】 目的： 探讨苦胆草对斯氏狸殖吸虫肝纤维化大鼠肝脏TIMP1表达的影响。 方法： 将42只SD大鼠随机分为正常组，模型组，γ干扰素组和苦胆草组。用斯氏狸殖吸虫感染大鼠制备肝纤维化模型，12周后取肝脏用半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术检测肝组织中TIMP1 mRNA的表达。 结果： 与正常组比较，模型组大鼠肝组织TIMP1 mRNA显著升高(P&<0.05);与模型组比较，γ干扰素组和苦胆草组大鼠肝组织TIMP1 mRNA的表达显著降低(P&<0.05)。 结论： 苦胆草的抗肝纤维化作用可能与其降低TIMP1表达有关。

【关键词】 苦胆草; 肝纤维化; 斯氏狸殖吸虫; 基质金属酶抑制因子1

　[Abstract] Objective: To explore the effects of gentiana scabra bage on the expression of hepatic TIMP1 in Paragonimus skrjabini infected rats with liver fibrosis. Methods: Forty two SD rats were pided into 4 groups： normal comparing group，model group， interferonγ group， gentiana scabra bage group. Use Paragonimus skrjabini infected rats， made them into liver fibrosis model. The rats were killed at the end of the twelfth weeks， TIMP1 mRNA were detected in liver samples with RTPCR. Results: Compared with the normal group， the expression of TIMP1 mRNA in the model group expressly raised(P&<0.05). However， compared with the model group， the expression of TIMP1 mRNA in the interferonγ group and the gentiana scabra bage group was obviously weakened(P&<0.05). Conclusion: Gentiana scabra bage treatment could reduce the TIMP1 significantly in Paragonimus skrjabini rats with liver fibrosis， thereby， played its role against hepatic fibrosis.

　　[Key words] gentiana scabra bage; liver fibrosis; Paragonimus skrjabini; tissue inhibitor of metalloproteinase1

　　近年来，随着医学分子生物学技术的应用，人们对肝纤维化发生机制进行了深入而广泛的研究，明确提出了肝纤维化完全有可能逆转的论点，国内外许多学者都在积极探索肝纤维化治疗的有效方法。苦胆草又名龙胆和草龙胆，性味苦、寒，是一种来源广、毒副作用少的常用中草药，主要有效成分是龙胆苦甙。现代药理研究证明，龙胆苦甙具有显著的肝脏保护、抗炎、抗病原微生物、中枢兴奋及健胃利胆等作用。本课题组前期研究表明龙胆苦甙对肝细胞有保护作用。本研究旨在探讨在大鼠肝纤维化形成过程中苦胆草对肝纤维胶原降解中关键酶TIMP1蛋白表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 动 物

　　SD大鼠42只，体质量(160±10)g，购自昆明医学院实验动物中心。

　　1.2 药品及试剂

　　DNA 标准参照物DL2000(宝生物工程)，DNA上样缓冲液(宝生物工程)，Trizol试剂(MolecularResearch Center)，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，PCR Master Mix Kit(Fermentas)，注射用重组人干扰素γ(上海克隆生物高技术有限公司)，苦胆草原粉由昆明医学院天然药物重点实验室提供。

　　1.3 方 法

　　1.3.1 动物模型的建立

　　每组每鼠经腹腔感染斯氏狸殖吸虫囊蚴15个。实验时将自溪蟹体内分离出来的新鲜囊蚴于解剖镜下计数，然后用生理盐水反复冲洗干净，再将实验动物腹部朝上固定剃毛消毒，用卡介苗注射器接大号针头，吸取己计数的囊蚴生理盐水混悬液注入腹腔，待囊蚴注入后留置针头，再吸取生理盐水边回抽边注射，力求囊蚴全部注入。

　　1.3.2 实验分组及处理方法

　　将大鼠随机分为4组：① 正常组(10只)，不做任何处理;② 模型组(12只)，于感染后8周剖杀2只大鼠，取其肝脏验证造模是否成功，余不做任何处理;③ 苦胆草组(10只)，自感染后8周起，先给予三氯苯达唑杀虫治疗4天，然后给予苦胆草灌胃治疗。剂量为3.2 g·kg-1·d-1，连续4周，治疗结束后剖杀大鼠取其肝脏;④ γ干扰素组(10只)，以γ干扰素替代苦胆草治疗，皮下注射γ干扰素15万单位·(只·天)-1，其余均与苦胆草组相同。取肝脏，用RTPCR方法检测肝组织中TIMP1 mRNA表达量。

　　1.3.3 肝脏病理学检查

　　取同一部位的肝组织用10%甲醛液固定，常规脱水，石蜡包埋、切片，进行VG胶原染色，观察肝纤维化的程度。

　　1.3.4 半定量RTPCR法检测TIMP1 mRNA表达

　　采用逆转录-聚合酶链反应法(RTPCR)严格按照试剂盒说明书操作[1]。① 引物序列，由大连宝生物工程公司合成。β肌动蛋白上游5′GTAAAGACCTCTATGCCAACA3′，下游5′ GGACTCATCGTACTCCTGCT3′;其PCR扩增产物为227 bp，② 用总RNA抽提试剂盒抽提各组的总RNA，用分光光度计测定总RNA含量及纯度，D260/D280均在1.8～2.0之间。③ 采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA。④ 共扩增PCR：设置β肌动蛋白为参照，TIMP1上游5′CATGGAGAGCCTCTGTGGAT 3′，下游5′GTTCAGGCTTCAGCTTTTGC3，393 bp[2];反应体系为25 μl，内含cDNA 1 μl， 2×PCR Master Mix 12.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.5 μl，TIMP1及β肌动蛋白上游、下游引物各0.5 μl， PCR water nuclefree 10.5 μl。反应参数为:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s， 总延伸72 ℃ 10 min，35个循环;⑤ TIMP1 mRNA表达半定量分析：PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，TIMP1及β肌动蛋白的扩增产物分别为393 bp，227 bp。用凝胶成像系统对DNA条带进行光密度扫描，以TIMP1/β肌动蛋白的比值表示TIMP1的相对表达水平。

　　1.3.5 统计学处理

　　采用SPSS 16.0统计软件包对所测得的各基因与β肌动蛋白平均光密度的比值进行处理，以均数±标准差表示，组间差异采用ANOVA分析，两组间比较采用SNK和LSD检验。

　　2 结 果

　　2.1 实验动物感染情况

　　在感染后8周随机选取模型组大鼠2只剖杀，大鼠肝脏大体观色泽偏暗， 欠光滑，体积未见明显变化，肝脏边缘变钝，质地较实，有结节感，在大鼠肝脏表面或切面均可见迂曲的窟穴状病灶或窦道，且检出了虫体(图1)，病理切片观察有较多纤维生成，证实肝纤维化形成，造模成功。图1 剖杀大鼠肝脏发现表面迂曲的窟穴状病灶或窦道

　　2.2 VG染色结果

　　正常组仅在血管壁、汇管区有极少量胶原纤维存在，肝小叶间未见纤维组织增生，无假小叶形成(图2a);模型组见汇管区大量胶原纤维增生，分布广泛，增生的胶原纤维形成纤维分隔，部分相互连接形成较粗大的纤维间隔，可破坏肝小叶结构，分割、包绕肝小叶(图2b);苦胆草组和γ干扰素组胶原纤维明显减少，少部分亦见胶原向周边延伸，无假小叶形成。苦胆草组与γ干扰素组比较无明显差异(图2c，2d)。图2 各组大鼠肝脏VG染色结果

　　2.3 不同组大鼠TIMP1 mRNA水平比较

　　采用BIORAD凝胶成像系统进行凝胶成像，用BIOGEL凝胶分析系统进行电泳条带光密度分析，计算各目的基因条带与β肌动蛋白光密度的比值，表示该基因相对表达水平(表1)。与正常组比较，模型组TIMP1基因表达量明显增高，差异有统计学意义(P&<0.05);苦胆草组，γ干扰素组与模型组比较，差异均有统计学意义(P&<0.05);苦胆草组与γ干扰素组比较差异无统计学意义(P&>0.05)。表1 各组大鼠肝组织TIMP1 mRNA表达相对值

　　3 讨 论

　　肝纤维化的发生不仅与肝内的细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)合成过多有关，而且与ECM降解水平密切有关，在肝内参与ECM降解的主要是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，其特异性组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)可对该酶活性产生抑制作用，两者与肝内ECM降解密切相关。TIMP1由多种结缔组织细胞产生，在肝脏由Kupffer细胞、肝星状细胞及肌纤维母细胞产生，以活化的肝星状细胞表达TIMP1最强[3]。由于TIMP1明显增高在肝损伤早期，越来越多的研究人员把它看成是肝纤维化发生、发展过程中的一个非常重要的促发因素，这给防治肝纤维化提供了重要契机。

　　有研究认为，肝纤维化在一定程度上与TIMPs基因水平高表达有关[4]。本实验RTPCR结果表明，模型组在感染斯氏狸殖吸虫囊蚴8周后，TIMP1水平随着肝纤维化的加重而明显增加，提示随着肝纤维化的发展，其基因表达水平呈递增趋势。苦胆草组给予三氯苯达唑杀虫治疗以消除成虫和虫卵继续沉积的影响，设γ干扰素作为阳性药物对照比较，对苦胆草抗肝纤维化的治疗作用做出客观评价。经苦胆草治疗后，肝组织中TIMP1的表达减少。我们推测苦胆草抗肝纤维化的作用可能是苦胆草抑制了TIMP1的表达，使基质金属酶的活性增强，降解胶原的能力增强，使胶原阳性面积减少。

参考文献

　[1] 王昭君，刘 佳，习杨彦彬，等.大鼠脊髓全横断后相关部位的BDNF表达[J]. 昆明医学院学报， 2007，28(6): 58- 61.

　　[2] Okada A， Garnier JM， Vicaire S， et al. Cloning of the cDNA encoding rat tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1)， amino acid comparison with other TIMPs， and gene expression in rat tissues[J]. Gene， 1994， 147 (2): 301-302.

　　[3] 刘占文，陈长勋，金若敏，等.龙胆苦苷的保肝作用研究[J].中草药，2002，33(1):47-51.

　　[4] Yoshiji H， Kuriyama S， Yoshii J， et al. Tissue inhibitor of metalloproteinases1 attenuates spontaneous liver fibrosis resolution in the transgenic mouse[J]. Hepatology，2002， 36(4):850-860.