TNFα在吸烟大鼠脑组织的表达及意义

　　　　 作者：刘淑杰，柳忠兰，宋一晨，刘菲

【摘要】 目的：观察不同吸烟量大鼠脑组织TNFα的表达，初步探讨吸烟导致脑缺血的发病机制。方法：建立吸烟动物模型，将60只健康Wistar大鼠随机分为A组(正常对照组)、B组(非吸烟对照组)、C组(短期吸烟组)、D组(长期小量吸烟组)、E组(长期大量吸烟组)、F组(戒烟组)，应用免疫组织化学方法观察各组大鼠脑组织TNFα的表达。结果：TNFα阳性细胞呈棕色，A组及B组大鼠脑组织中TNFα阳性细胞表达极少，两组比异差较无显著性(P&>0.05)，CE各组表达比其它各组明显增多，F组TNFα表达下降，与其它各吸烟组相比差异有显著性(P&<0.05)。结论：吸烟导致大鼠脑组织TNFα的表达升高，戒烟后表达下降，TNFα表达升高可能是吸烟导致脑梗死的主要途径之一。

【关键词】 吸烟;大鼠;脑组织;TNFα

　　AbstractObjective：To　observe　the　expression　of　TNFα　on　smoked　rats　brain　tissue　of　different　groups，and　try　to　explore　the　possible　mechanisms　of　TNFα　in　ischemic　cerebral　vascular　diseases(ICVD).Methods：Animal　model　of　smoked　rats　were　made，MethodHealthy　Wistar　rats　were　randomly　pided　into　six　groups　of　ten　animals　for　each　one.A　group(the　normal　control　group)，B　group(the　nonesmoking　control　group)，C　group(shorttime　smoking　group)，D　group(longtime　and　smalldose　smoking　group)，E　group(longtime　and　bigdose　smoking　group)，F　group(givingup　smoking　group).The immunohistochemical method was used to observe the expression of TNFα in every group.Results：The　positive　cells　of　TNFα　showed　brown　and　located　neurocyte　neurogliocyte　and　vascular　endothelial　cell.There　were　a　few　expression　in　group　A　and　group　B(P&>0.05).The　expression　in　group　C，D，E　were　stronger　than　group　A，B.The　expression　in　group　F　was　lower　than　group　C，group　D　and　group　E(P&<0.05).Conclusion：Exposure　to　smoking　can　elevate　the　expression　of　TNFα.While　givingup　smoking　can　reduce　the　expression　of　TNFα.The　elevating　expression　of　TNFα　may　be　one　of　the　ways　for　ICVD　after　exposured　to　cigarettes.Givingup　smoking　can　prevent　and　reduce　the　ICVD.AntiTNFα　maybe　a　new　way　for　prevention　ICVD.

　　Key wordssmoking;rat;brain tissue;TNFα

　　肿瘤坏死因子α(TNFα)在缺血性脑血管病中的作用日益受到众多学者的重视[1]，现已证实TNFα能够刺激血管内皮细胞表达粘附分子，介导白细胞与血管内皮细胞的粘附。本实验通过大鼠吸烟模型，应用免疫组织化学方法对吸烟后大鼠脑组织中TNFα的表达进行了观察，探讨TNFα在吸烟引起脑血管病方面的可能机制，为缺血性脑血管病的预防和治疗提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物及分组 健康成年Wistar大鼠60只，体重(250±10)g，由中国医科大学实验动物中心提供，随机分成6组(每组10只)。A组(正常对照组)：正常喂养大鼠，不做任何处理;B组(非吸烟对照组)：实验条件与吸烟鼠相同，不做吸烟处理;C组(短期吸烟组)：每天吸烟两次，每次12支，连续吸烟半个月;D组(长期小量吸烟组)：每天吸烟两次，每次3支，连续三个月;E组(长期大量吸烟组)：每天吸烟两次，每次12支，连续三个月;F组(戒烟组)：每天吸烟两次，每次12支，连续吸烟一个月后，戒烟一个月。

　　1.2 动物模型的制备 将大鼠关进自制80　cm×60　cm×58　cm的烟箱中，该箱上方有一通风口与外界相通，侧壁有一个与香烟直径相同的孔，点燃的香烟烟雾由侧壁孔处扩散至整个箱内，使箱内形成空气与香烟烟雾相混环境，大鼠在此环境中吸烟。实验用烟为市售某牌香烟，尼古丁含量1　mg/支，焦油含量18　mg/支。非吸烟对照组大鼠也同时被关进与“吸烟箱”规格、结构相同的箱内以相同时间，只是不输入香烟烟雾。

　　1.3 灌流固定及取材 实验完毕后次日分别从各组随机取出10只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛(350　mg/kg)麻醉成功后，经左心室-主动脉用1%肝素化生理盐水150ml快速冲洗灌流，用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液250　ml灌流固定，待固定充分后开颅取全脑置相同固定液中后固定。

　　1.4 石蜡标本的制备 取距离额极6　mm处2　mm厚冠状脑片组织，常规进行水洗，材料脱水、浸蜡、包埋处理，入LKB8600超薄石蜡切片机上切取冠状脑片连续切片10张，厚度约5　μm，取相邻切片，分别行HE染色，TNFα免疫组化染色。各组大鼠选择切片的层面保持一致。

　　1.5 免疫组化染色 采用免疫组化SABC法，兔抗大鼠TNFα抗体及SABC试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，操作步骤严格按说明书进行。

　　设置对照：用0.1　MPBS代替一抗作阴性对照。

　　1.6 结果判断及统计学处理 光学显微镜下观察各组免疫组化切片，阳性反应物沉积情况：阳性反应物为突出于背景的棕黄色沉积，未见明确棕黄色沉积或着色浅淡与背景几乎一致者为阴性。实验数据以均数±标准差表示，用统计软件SPSS10.0行统计学处理，结果采用方差分析样本均数，应用q检验，做组间两两分析比较，P&<0.05有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 光镜下TNFα阳性反应物表达情况 (1)阴性对照脑切片无阳性反应物出现。(2)A组及B组有少量TNFα表达，二者比较无差异(P&>0.05)。(3)C组：脑区TNFα表达与A组及B组比较明显升高(P&<0.05)。(4)吸烟组：脑区TNFα表达与A组及B组比有显著升高(P&<0.01)，E组表达最多，与C组及D组比较亦有显著差异(P&<0.01)。(5)F组：脑区TNFα表达较A，B组表达升高(P&<0.05)，但较C组及D组，E组表达减少，并有显著差异(P&<0.05)。

　　2.2 计数各组平均阳性细胞数 在切片由皮质到白质依次观测5个不重复高倍视野(400×)，测出TNFα的阳性细胞数，各组数据以均数±标准差表示(表1)。表1 吸烟对大鼠脑组织TNFα表达的影响

　　3 讨论

　　吸烟是促进脑梗死形成的重要危险因素，吸烟引起缺血性脑血管病的确切机制不清楚，大量研究表明炎性细胞因子介导的炎性反应在脑梗死形成中起着重要作用[2]，研究吸烟后TNFα的变化对探讨吸烟引起脑梗死发病机制有重要意义。

　　香烟燃烧的烟雾可分为气体和微粒两部分，其中主要的有毒复合物包括一氧化碳(CO)、尼古丁和焦油。尼古丁和焦油等有害物质可直接损害血管内皮细胞，导致血管内皮功能失调[3]。尼古丁可使血管内皮细胞脱落。目前，普遍认为，血管内皮细胞不仅是血管腔内的一层保护细胞，而且有抗凝、抗血栓形成及纤溶等广泛生理功能，并且广泛参与了许多疾病的病理过程，内皮细胞损伤是动脉粥样硬化及脑梗死的早期病变和基本动因。其功能降低主要表现在正常的抗凝、抗细胞粘附和抗氧化机能减退，与此同时，内皮细胞表达的粘附分子和炎性细胞因子增高。

　　在脑梗死形成过程中，炎症反应起着重要作用，TNFα是主要的致炎因子，吴苏宁等[4]对60例急性脑梗死患者进行检测，发现脑梗死患者急性期和恢复期TNFα明显高于正常对照组，梗死灶越大者，TNFα含量越高。提示TNFα参与了脑梗死的病理生理过程。本实验发现TNFα主要表达在小胶质细胞、星形细胞、神经细胞及活化的内皮细胞上，与文献报道一致。各个吸烟组脑组织中均有TNFα表达，与对照组比较有显著升高，戒烟后TNFα表达较对照组升高，但与各吸烟组比较表达下降。TNFα表达升高确切机制不详，可能是由于内皮细胞受到吸烟等有害因素刺激后合成和分泌。文献报道，内皮细胞受到一些因子(如炎症、吸烟、高血压等)刺激后合成多种细胞因子，一旦血管内皮受损，不仅暴露的内皮下层可使血小板粘附聚集，导致血栓形成，而且受刺激的内皮细胞可合成多种细胞因子，如TNFα、IL1　、IL6等。TNFα对神经组织的作用主要有：上调了粘附分子如Eselectin、ICAM1等的表达，使血管内皮粘附大量的中性粒细胞引起血管的炎性反应;与血管的内皮细胞相互作用，而导致血管内皮细胞表面凝血和抗凝机制平衡失调，促成凝血状态;影响血管收缩活性物质的表达，促进血管收缩。

　　本实验结果也提示，吸烟引起TNFα增高与吸烟时间及吸烟量有一定关系，吸烟量越大，吸烟时间越长，TNFα表达越多，这可能的机制有长期大量吸烟使血管内皮破坏严重，吸烟加速颈动脉内膜增生与吸烟量有关，戒烟后血管内皮修复。TNFα表达与血管内皮受损有关。TNFα表达增加，可诱导Eselectin和ICAM1等的表达，使白细胞、血小板粘附于微血管内，导致微血管阻塞，增加了血栓形成的可能性。

参考文献

　[1]Chopp　M，Li　Y，Jidng　N，et，al.Antibodies　against　adhesion　molecules　reduce　apoptosis　after　transient　middle　cerebral　artery　occlusion　in　rat　brain[J].J　Cereb　Flow　Metab，1996，16：578-584.

　　[2]Haring　HP，Borg　EL，Sturnshita　N，et，al.Eselectin　appears　in　nonischemic　tissue　during　experiment　focal　cerebral　ischemica[J].Stoke，1996，27：1386.

　　[3]Lin　SJ.Risk　factors，endothelial　cell　tumover　and　lipid　transport　in　atherogensis[J].Neuroscience，1996，58(5)：309-316.

　　[4]吴苏宁，张晓霞.急性脑梗死患者血清肿瘤坏死因子及循环内皮细胞含量变化的对比研究[J].中风与神经疾病杂志2000，17(3)：149-151.