电刺激隐神经对大鼠脊髓cfos基因表达的影响

　　　　作者：杨宇，杨静玉，郭丽，商丽宏3，陈魁敏，吴敏范，韩清

【摘要】 目的：观察躯体伤害性刺激能否引起脊髓神经元细胞内cfos基因表达的改变。方法：用免疫组化方法研究躯体伤害性电刺激隐神经后不同时间，脊髓神经元细胞内cfos基因表达的变化。结果：伤害性电刺激隐神经能够引起脊髓神经元Fos蛋白表达的显著增加;伤害性电刺激隐神经后30min明显增加，60min增加最明显，120min后开始消退。结论：本研究证明伤害性电刺激隐神经能够引起脊髓神经元Fos蛋白表达的显著增加，这种表达呈时间依赖性。

【关键词】 cfos基因;脊髓;隐神经;躯体痛;免疫组化

　　Effect　of　Electrically　Stimulating　Saphenous　Nerve on　cfos　Gene　Expression in　Spinal　Cord　Neurons　of　Rats

　　YANG　Yu1，YANG　Jingyu1，GUO　Li2，SHANG　Lihong3，CHEN　Kuimin3，WU　Minfan4*，HAN Qing5

　　(1.Life　Science　and　Biopharmaceutical　College，Shenyang　Pharmaceutical　University，Shenyang　110015，China;2.Scientific　Experimental　Center　of　Shenyang　Medical　College;3.Functional　Experimental　Center　of　Shenyang　Medical　College;4.Department　of　Physiology，Shenyang　Medical　College;5.Depart of Hygiene，PLA 95979 Army)

　　AbstractObjective：To　observe　the　expression　changes　of　the　cfos　gene　in　spinal　cord　neurons　by　somatic　noxious　stimulation.Methods：The　electrical　stimulation　of　saphenous　nerve　at　different　times　was　studied，the　changes　of　spinal　cord　neurons　cfos　gene　expression　were　observed　by　immunohistochemical　technique.Results：Spinal　cord　Fos　protein　expression　could　lead　to　a　significant　increase　by　immunohistochemical　technique，noxious　electrical　stimulation　increased　significantly　30　minutes，the　most　significant　increase　60　minutes，then　fades　after　120　minutes.Conclusions：This　study　proved　the　noxious　electrical　stimulation　of　saphenous　nerve，the　spinal　Fos　protein　expression　can　lead　to　a　significant　increase，this　expression　is　timedependent.

　　Key wordscfos　gene;spinal　cord;saphenous　nerve;somatic　pain;immunohistochemistry

　　痛觉是一种不愉快的感觉和情绪体验，伴有实际或潜在的组织损伤。疼痛是最普遍的临床症状之一，虽然治疗方法很多，但疗效均不尽人意，给患者带来巨大痛苦，是临床治疗一大难题。脊髓后角浅表层既是接受躯体伤害性信息传递的初级门户又是对伤害性信息处理的重要部位，是接受和调制痛觉信号的重要中枢[1]，因此脊髓后角是探索躯体痛和镇痛机制首当其冲的研究部位[2]。

　　cfos基因是编码核蛋白的基因，它既是一种原癌基因[3]，广泛存在于真核细胞基因组中的基因，又是即刻早期表达基因在中枢神经系统内的表达与痛觉密切相关[4]。研究发现，机体在受到外周伤害性刺激后，cfos基因被激活并表达Fos蛋白，是目前较为理想的中枢神经元对伤害性刺激反应的疼痛标志物。因此用cfos原癌基因及其编码的相关蛋白来判断、追踪伤害性刺激隐神经(saphenous　nerve，SN)的信号在脊髓神经元细胞内信号传导通路，以确定与伤害性信息传递、中继或整合有关的表达区域[5，6]。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠60只，体重230～270g，沈阳医学院实验动物中心提供;戊巴比妥钠(购自SIGMA，美国);cfos抗体(购自Santa　Cruz　Biotechnology，Int.);ABC免疫组化试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 实验动物分组 健康雄性Wistar大鼠实验前于室温下适应性饲养1周，自由摄食饮水，自然昼夜节律光照。随机分组，每组6只，分别为：空白对照组;实验对照组;1.0　mA电刺激SN后30　min、60　min、120　min实验组。

　　1.2.2 躯体痛动物模型制备 1%戊巴比妥钠40　mg/kg体重腹腔麻醉。暴露左后肢SN，结扎离中端，向中端置双极银丝保护刺激电极，极间距离为2.5　mm;并置神经蜡和明胶海绵以绝缘并吸收体液，防止因电流外溢引起的周围组织兴奋所致的躯体性传入的影响，防止神经干燥。电刺激SN的刺激参数为强度1.0　mA，波宽0.5　ms的单脉冲方波。分别在刺激SN后30　min、60　min、120　min迅速断头取脊髓。实验对照组手术暴露SN，只放置刺激电极而不施加电刺激。

　　1.2.3 免疫组化法检测cfos基因的表达 将取出的大鼠脊髓放于4　℃多聚甲醛中固定过夜。冰冻切片机在-20　℃的环境下工作，切片厚度为15　μm，同时用苏木素速染，显微镜下观察，至脊髓腰段和上骶段后切片、留片。切片自然干燥，2 h后用冷丙酮(-20　℃)固定10　min，取出后待丙酮挥发完全，置于-20　℃冰箱中保存待用。于-20　℃冰箱中取出切片，室温下置于PBS中10　min，2次;用0.3%　h3O2甲醇孵育30　min，PBS冲洗10　min，3次;高温高压抗原恢复，正常兔血清封闭，37　℃孵育30　min;加一抗，37　℃孵育1h;PBS冲洗10　min，3次;加生物素标记二抗，37　℃孵育30　min;PBS冲洗10　min，3次;加ABC试剂(辣根酶标记链霉卵白素)，37　℃孵育30　min。PBS冲洗10　min，3次;DAB试剂显色，苏木素复染;70%、90%、100%梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。显微镜观察。

　　1.2.4 图像分析 采用显微图像分析仪对切片进行图像分析：所有切片均在同一放大倍数(×400)及同一光强度下分析。每组6只大鼠，每只大鼠测5张切片，取平均值。观察指标包括阳性细胞积分光密度及阳性细胞面积。视场范围1.23　μm×106　μm。

　　1.2.5 统计学处理 EXCEL2003处理所有数据，采用平均值±标准差(x±s)表示，数据用t检验进行统计处理，P&<0.05时，差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 正常大鼠脊髓后角神经元cfos基因的表达 正常大鼠脊髓内仅有少量Fos蛋白表达，主要分布于细胞核内，经DAB显色后，cfos阳性神经元的胞核染成棕褐色，大小不等，多为圆形或椭圆形，较大的细胞可见核仁透亮区，如图1所示。

　　2.2 电刺激隐神经后不同时间大鼠脊髓后角神经元cfos基因的表达 与对照组相比，伤害性电刺激SN后30　min，诱导脊髓神经元Fos蛋白表达显著增加，积分光密度和阳性细胞面积百分比显著增加(P&<0.05);伤害性电刺激SN后60　min，诱导脊髓神经元Fos蛋白表达增加达高峰，积分光密度和阳性细胞面积百分比显著增加(P&<0.01);伤害性电刺激SN后120　min，诱导脊髓神经元Fos蛋白表达显著增加，但开始消退，积分光密度和阳性细胞面积百分比显著增加(P&<0.05)，见表1、图1、图2。因此，伤害性电刺激SN可诱导脊髓腰骶段神经元Fos蛋白的表达增强。这种表达呈时间依赖性，伤害性电刺激SN后30　min明显增加，60　min增加最明显，120　min后开始消退。

　　空白对照实验对照电刺激SN后30　min电刺激SN后60　min电刺激SN后120　min图1 电刺激隐神经后不同时间脊髓神经元cfos表达的影响表1 电刺激隐神经后不同时间对脊髓神经元cfos基因表达的影响

　　3 讨论

　　cfos原癌基因是一种即刻早期基因，是快速、一过性表达的基因[7]。当中枢神经元受到物理、化学等各种刺激后，激活受体和第二信使，诱导cfos在胞浆中转录合成mRNA，再翻译成原癌基因蛋白Fos，Fos蛋白进入胞核中与目的基因结合，激活目的基因的表达而对刺激作出反应。Fos蛋白一般在刺激后20～90　min即可用免疫组化方法显示其分布状态[8]，60～90min达峰值，可持续2～5　h，半衰期为2　h[9]　。因此，Fos蛋白可作为神经元参与刺激信号传导和调控的一种标志[10]。

　　本实验的空白对照组和实验对照组均可见脊髓神经元Fos蛋白的少量表达，提示在正常情况下，正常细胞有低水平的Fos蛋白表达。本实验首次观察到在电刺激SN后30～120　min时，脊髓神经元Fos蛋白表达呈时间依赖性显著增加，高峰出图2 电刺激隐神经后不同时间对脊髓神经元cfos基因表达的影响

　　A为积分光密度，B为阳性细胞面积百分比，与空白和实验对照组比较*P&<0.05;**P&<0.01现在电刺激后60　min左右，可能由SN中Aδ纤维和C纤维兴奋所引起[2]。SN传入的伤害性信息可能易化了某种痛觉传递过程，导致脊髓疼痛“标志物”Fos蛋白表达的增强。因此本实验证明了SN传入的伤害性信息能够到达脊髓，Fos阳性神经元大多是传递通路上的二级神经元或中间神经元，介导外周伤害性信息在脊髓的传递。为人类对镇痛机理研究、镇痛方法的应用以及镇痛新药的研制提供了实验基础，为临床镇痛治疗提供理论依据。

参考文献

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　　[2]Vikman　KS，Duggan　AW，Siddall　PJ.Increased　ability　to　induce　longterm　potentiation　of　spinal　dorsal　horn　neurons　in　monoarthritic　rats[J].Brain　Res，2003，990：51-57.

　　[3]Bishop　JM.Molecular　themes　in　oncogenesis[J].Cell，1991，64(2)：235-248.

　　[4]Mattson　MP.Excitotoxic　and　excitoprotective　mechanisms：abundant　targets　for　the　prevention　and　treatment　of　neurodegenerative　disorders[J].Neuromolecular　Med，2003，3(2)：65-94.

　　[5]Lei　LG，Zhang　YQ，Zhao　ZQ.Painrelated　aversion　and　Fos　expression　in　the　central　nervous　system　in　rats[J].Neuroreport，2004，15(1)：67-71.

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　　[7]Hunt　SP，Pini　A，Evan　G.Induction　of　cfoslike　protein　in　spinal　cord　neurons　following　sensory　stimulation[J].Nature，1987，328：632-664.

　　[8]张遐，鞠躬.cfos癌基因的诱导和显示　　一种反映神经功能通路的方法[J].生理科学进展，1991，22(4)：229-303.

　　[9]Hayashi　M，Ueyama　T，Nemoto　K，et　al.Sequential　mRNA　expression　for　immediate　early　genes，cytokines，and　neurotrophins　in　spinal　cord　injury[J].J　Neurotrauma，2000，17(3)：203-218.

　　[10]Deepak　A，Scott　C，Roger　B，et　al.Early　gene　expression　in　the　rat　cortex　after　experimental　traumatic　brain　injury　and　hypotension[J].Neurosci　Lett，2003，345(1)：29-32.