【摘要】 目的：观察三种不同负荷条件下血管内皮生长因子(VEGF)在小鼠心肌组织中的表达，并进一步阐明不同负荷对机体心脏中心室肌和心房肌不同代偿能力的影响规律。方法：雄性2月龄昆明小鼠30只，每只体重(34±1.87)g，用国家标准啮齿类动物饲料饲养，自由进食进水。适应性喂养1周后，随机分为3组，每组10只，对训练组进行训练。训练完成后取其心脏，固定包埋后作HE和免疫组化染色，观察各组的体重改变、VEGF表达状况。利用IMAGE PRO PLUS 5.1图像分析软件测量面积比。结果：三组小鼠中120 min+负重组随着训练时间的延长而逐渐不能顺利地完成任务，游完后都表现筋疲力尽;而其它两组的小鼠活动状态一直较好。静养对照组VEGF表达为阴性;120 min组表达为弱阳性;120 min+负重组表达为阳性。分析其阳性面积比(阳性面积/视野面积)，120 min组和120 min+负重组均与静养对照组有明显性差异，120 min组与120 min+负重组也有明显性的差异。结论：一定的运动可以使心肌分泌VEGF，在适宜的时间内，运动的强度越大，VEGF的表达就越强烈，这对心房肌的影响较大，而对心室肌的影响不大，并有一定代偿作用。
【关键词】 运动负荷;小鼠;心室肌;心房肌;血管内皮生长因子
AbstractNFDEAObjective：To observe the changes of VEGF expression in mice myocardium under three different load conditions.And further to expound the rules that the regeneration blood vessel ability influenced by the different loads.Methods：As experimental objects，30 Kunming male mice that each one weight (34 ± 1.87)g with feeding by the state standards of rodents feeding and free eating influent were pided into 3 groups randomly after a week feeding adaptability， that was， the control group、the 120 minutes group、the 120 minutes + burdened group. Upon completion of the training， the heart was removed.They were fixed by H.E.and stained immunochemically after embedding.The change in the body weight and VEGF expression were observed.IMAGE PRO PLUS 5.1 image analysis software was used to measure area ratio.Results：120 minutes + burdened group of three groups with the reorganization of the training time could not be extended gradually to the smooth completion of tasks.They had shown exhaustion after training.And the other two groups of mice activities in the state had been better.Three groups of mice in eight weeks of training time drank water and ate better.Their weight had been showing an upward trend.The control group displayed for the negative VEGF expression.The 120 minutes group displayed weakly positive expression. Analysis of the positive area ratio (positive area / field area)， 120 min and 120min + negative re-group with the aim of keeping the control group were significantly different， 120 min and 120 min + group there was a marked reorganization of the negative difference.Conclusions：Certain movement can secrete VEGF.In the appropriate time， with campaign greater， the intensity of VEGF express stronger.And it is not likely to cause serious cardiac injury.Training of athletes at the daily exercise of general population must achieve remarkable results with maintaining a certain degree of effective time.
Key wordsNFDEA exercise load;mice; ventricular myocardium;atria myocardium;vascular endothelial cell growth factor
长时间的力竭游泳运动可以导致多项生理机能的改变，很少有对其心室肌和心房肌分开来进行研究。本文不仅仅分析小鼠在力竭游泳后的心肌改变，还通过免疫组化手段来了解运动后小鼠心脏中心室肌和心房肌的改变状况。在参照艾洪滨[1]等对正常小鼠的宽频带心电图的研究以及步斌[2]的运动负荷与沙棘对大鼠心肌VEGF表达影响的研究之后，采用游泳方法建立小鼠运动模型，观察了不同运动负荷使小鼠心房肌和心室肌从形态到功能发生的改变。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物及分组
取2月龄雄性昆明小鼠30只，每只体重约(34±1.87)g(由湖北省实验动物研究中心提供)，用国家标准啮齿类动物饲料饲养，生活期间室温保持(25±2) ℃，相对湿度(51%±4%)，每天光照8 h。适应性喂养1周后，随机分为3组，每组10只。
1.1.2 实验仪器
常规手术器械;塑料水池(150 cm×32 cm×80 cm，自制);切片机(LAICA，德国);隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);机械不锈钢烧烤微波炉(格兰仕);光学显微镜(OLYMPUS，日本);图像分析系统(IMAGE PRO PLUS 5.1，美国)。
1.1.3 免疫组化主要试剂
VEGF抗体(一抗、二抗)、免疫组化SP试剂盒、DAB均由武汉博士德公司提供。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立
先选取一只小鼠测试其无负重时的游泳时间，为3 h;再分别以2%、5%、8%的负重测试其游泳时间，以力竭为标准(力竭判断标准为大鼠沉入水底10 s不浮起，无法完成翻正反射)，分别为2 h30 min、2 h、1 h50 min，结合张志琪所作实验[3]，确定游泳时间为2 h，尾部负体重的5%。随后将小鼠随机分成三组：A.静养对照组：平时不运动，饲养条件与另外两组相同，每当另两组小鼠训练时，此组小鼠也放入温度相同的浅水中，浸泡120 min;B.120 min组：进行中等强度游泳训练，游泳池体积为150 cm×32 cm×80 cm，水深25 cm，水温(32±1) ℃，每周训练6 d，每天训练1次。第一次下水10 min，此后逐日累加到第一周末时游泳时间达到60 min/d，第二周末达到120 min/d。以后维持这一运动量直至第8周;C.120 min+负重组：在与120 min组训练条件和方法相同的情况下，在同一时间放入水中，并且以光滑铁棍对小鼠进行驱赶，使得小鼠在负重5%体重的120 min的时间里不间断的进行运动，结束后即刻用毛巾擦干。
1.2.2 取材及标本制备
最后一次训练完毕后即刻活体解剖，迅速打开胸腔，心室上作十字形切口，割断大动静脉，取出心脏，放入4%多聚甲醛中固定。标本固定2 h后，分别经浓度为50%的酒精2 h、70%的酒精2 h、80%的酒精1 h、90%的酒精1 h、100%的酒精1 h、100%的酒精1 h进行脱水，脱水后经两次二甲苯各30 min透明。随后依次放进48～50 ℃、54～56 ℃、56～58 ℃的石蜡中浸蜡1 h，石蜡包埋、切片。石蜡切片的厚度为2μm。其它免疫组化方法依照博士德产品说明进行。
1.2.3 图像分析方法
显微镜均取×40倍，每组测定2张切片，每张切片随机选取4个视野进行图像采集，视野主要集中在心肌的左心室上。以视野为单位，每组共8个视野。利用IMAGE PRO PLUS 5.1图像分析软件测量面积比。VEGF染色是否为阳性以PBS液代替一抗所得切片对照作标准。
1.3 统计学处理
所有数据均经过SPSS11.5统计软件处理，所测数据采用平均值±标准差来表示，P&<0.05为差异具有显著性。
2 结果
2.1 三组小鼠一般情况的对比观察
静养对照组的小鼠神态安静、活泼好动、时而静息。皮毛光亮、眼睛有神，在配给相同类型食料的情况下，静养对照组进食量与120 min组相接近，而多于120 min+负重组。解剖后见内部各器官色泽鲜红，供血情况良好，体脂分布正常，未见器官肌肉萎缩等情况。120 min组，偶尔有气喘，饮水量和进食量稍增加外，神态和皮毛等无明显变化。解剖后，发现体脂分布减少外，内脏各器官色泽鲜红，供血良好，未见器官肌肉萎缩等情况。120 min+负重组的训练随着训练时间的延长神情倦怠、眼神暗淡无光、体毛有部分脱落。解剖可见，体脂分布明显减少，内脏器官色泽暗红，供血较差，部分脏器淤肿。三组小鼠中120 min+负重组随着训练时间的延长而逐渐不能顺利地完成任务，游完后都表现筋疲力尽，而其它两组的小鼠活动状态一直较好。
2.2 三组小鼠心肌组织变化的特点
各组小鼠解剖心脏时肉眼观，呈鲜红色，弹性好大体无明显变化，但120 min+负重组的心室壁较其它两组的心室壁要肥厚。静养对照组HE染色切片在×40倍的光镜下(图1)，可见心肌纤维呈短柱状，分支相互连接成网，境界清楚，胞浆均匀红染，心肌纤维排列整齐，核大小正常，呈椭圆形位于细胞中央，细胞间质较少，毛细血管形态、分布正常，内皮细胞、基膜无肿胀增厚、无炎性细胞浸润。120 min组HE染色切片在光镜下(图2)，可见心肌纤维部分增粗，胞核增大，血管腔扩张，无明显的心肌细胞变性、坏死。而对120 min+负重组的HE染色切片进行观察(图3)，发现部分心肌纤维增粗，胞核增大，部分细胞肿大，核周呈空泡样变，心肌细胞核周隙扩张，核着色浅，细微结构不清，并可见部分毛细血管和小动脉、静脉淤血，少量炎细胞浸润，内皮细胞肿胀，腔内红细胞淤滞。图1 静养组心肌纤维呈短柱状，分支相互连接成网，境界清楚，胞浆均匀红染(HE×40)图2 120 min组心肌纤维部分增粗，胞核增大，血管腔扩张，无明显的心肌细胞变性、坏死(HE×40)图3 120 min+负重组心肌纤维增粗，胞核增大，部分细胞肿大，核着色浅，细微结构不清，并可见淤血(HE×40)
2.3 三组小鼠的VEGF染色结果对比
静养对照组VEGF表达为阴性，满视野染色均匀，有散在VEGF的特异性的棕黄染色颗粒(图4);120 min组心房肌中可见在细胞间质内有少许的棕黄颗粒，心室肌明显较少(图5);而在120 min+负重组中可见心房肌中大量存在有棕黄颗粒，使得满视野中充满了棕黄色(图6)， 120 min组心室肌边缘部分中可见在细胞间质内只有少许的棕黄颗粒(图7);120 min+负重组心室肌中细胞间质内有少许的棕黄颗粒(图8)。而心室肌也较心房肌较少。分析其阳性面积比(阳性面积/视野面积)，120 min组和120 min+负重组均与静养对照组有明显性差异，120 min组与120 min+负重组也有明显性的差异，如表1。表1 三组小鼠心肌VEGF表达情况图4 仅有散在的VEGF的特异性的棕黄染色颗粒(ELISA×40)图5 120 min组心房肌中可见在细胞间质内有少许的棕黄颗粒(ELISA×40)图6 120 min+负重组中可见心房肌中大量存在有棕黄颗粒(ELISA×40)图7 120 min组心室肌边缘部分中可见在细胞间质内只有少许的棕黄颗粒(ELISA×40)图8 120 min+负重组心室肌中细胞间质内有少许的棕黄颗粒(ELISA×40)
3 讨论
运动对心脏心肌的影响一直是运动医学领域探讨的热点问题，在先前的研究中发现适宜的训练强度可使心肌的形态结构得到改善，过度训练可致心肌细胞受损[4]。但目前尚少见通过VEGF影响来探究心室肌和心房肌的改变。不同负荷的运动训练是否会对心室肌和心房肌产生不同的影响，是本实验研究的重点问题。我们选取两个方面来讨论，即体重、心肌中VEGF表达的状况。大量动物实验研究发现[5]，适宜的运动可使心脏肌纤维增粗，心肌结构发生协调性变化，线粒体数量增多，心肌毛细血管增多，运动使心肌蛋白合成增加。而不适宜运动导致心肌受损，突然进行较大强度或衰竭运动导致心肌缺血而出现病理变化。而缺氧是刺激VEGF表达的重要因素[6]。业已证明，许多组织无论是缺氧还是缺血，VEGF mRNA的表达总是增加。这一现象是否也存在于心脏?国外学者在鼠、猪、狗的不同形式造成的心肌梗死或心肌损伤的动物模型中均发现VEGF的异常表达[7，8]。Banai[9]等还发现，体外培养的心肌细胞缺氧2～4 h，细胞内的VEGF mRNA水平增高6～10倍;而在体内，当心肌缺氧时心肌细胞中VEGF mRNA水平可以增高3～5倍。在显微镜下看见，部分心房肌肌纤维增粗，胞核增大，部分细胞肿大，核周呈空泡样变，心房肌肌细胞核周隙扩张，核着色浅，细微结构不清，并可见部分毛细血管和小动脉、静脉淤血，少量炎性细胞浸润，内皮细胞肿胀，腔内红细胞淤滞。但是心室肌则没有那么的明显。这说明随着负荷的加大，机体进一步激活了内皮生长因子，但这是以部分心房肌细胞的损伤作为代价的。
分析其机制，小鼠身体中大部分都有VEGF分布，心房、心室和瓣膜中也都有VEGF分布。正常情况下，心房、心室肌细胞低水平表达VEGF，维持一定血管密度和血管对运输营养物质所必需的通透性。研究发现缺血缺氧均可诱导心肌细胞表达VEGF增强，而且坏死区周围明显高于非坏死区。在运动过程中，心脏的缺血、缺氧现象存在，当运动负荷适当时，心脏的缺血、缺氧并不对心脏造成严重损伤，这可能与适宜运动时心房肌组织内抗氧化系统能力提高及适宜运动时心肌组织内毛细血管数量增多，提高冠脉血流量和毛细血管的交换能力有关。而在运动超过了一定量的情况下，心肌细胞自由基增多、钙超负荷，并发生缺血、缺氧性损伤，毛细血管损伤后密度下降，心房肌肌细胞与间质的胶原间正常比例遭到破坏，心脏由代偿性生理肥大向失代偿性病理性肥大转变。本实验结果显示在一定量的运动负荷下可以促进心房肌细胞分泌VEGF，可能是因为运动造成心肌缺血缺氧，从而诱导VEGF表达增强，这与文献报道相一致;而120 min+负重组比120 min组心房肌细胞分泌VEGF更强，可能是因为加大强度负荷运动后心房肌细胞在一定程度上受到损伤，心房肌缺血缺氧，心房肌细胞病变尚不足引起大量分泌VEGF的缘故或大强度负荷组大鼠对心肌损伤产生适应性改变，这些都会使的VEGF再次对内皮细胞产生刺激，内皮细胞从而增殖，在体内诱导血管生成。三组试验小鼠的心脏，随着所受负荷的增加，表现出代偿到失代偿的变化，并且通过免疫组化染色可以推论出心房肌的失代偿程度较心室肌更为明显，这与心室肌更为敏感的传统观念相反。可能是心房肌对缺血缺氧较心室肌更为显著所致。因为不同心肌细胞膜上的离子通道的类型、数量及其开合的条件是不完全一样的，因而不同心肌细胞的生物电活动也不尽相同。可能是长时间大负荷的游泳对心房肌细胞和自律细胞膜上的离子通道的抑制较大，导致离子通道开启数量的下降，而对心室肌细胞膜上的离子通道的影响并不显著，甚至一部分离子通道受长时间的游泳而增强。
以上这些都与心房肌中VEGF的表达结果相符。在心肌中，缺氧有明显增加VEGF表达的作用[10-12]。VEGF是内皮细胞特异性有丝分裂原，具有促进内皮细胞分裂、增殖、迁移，形成新生血管的作用。血管内皮细胞只是VEGF作用的靶细胞，其本身并不表达VEGF。VEGF mRNA在心脏中主要位于心肌细胞，低氧促使心肌细胞表达VEGF mRNA、分泌VEGF蛋白增加，可能是机体的一种代偿机制。分泌出的VEGF蛋白作用于血管内皮细胞膜上的VEGF受体Flk-1、Fit-1，通过一系列信号传导使内皮细胞分裂、增殖、迁移，形成新生血管，建立侧支循环，增加缺氧/缺血心肌的氧供/血供，从而减轻或逆转心肌细胞的受损，改善心功能。不同运动负荷训练对机体产生不同的影响，有研究表明血管内皮细胞在正常情况下低表达VEGF，但当内皮细胞被置于缺氧环境时，细胞内VEGF mRNA水平明显增加[2]，这表明VEGF不仅通过旁分泌途径作用于内皮细胞，而且有自分泌机制参与。在本试验中，120 min组的小鼠在经过了8周时间的训练后小鼠精神状态、体重、饮食饮水量、大小便等与对照组无明显负面影响，这表明了心肌细胞在训练过程当中产生了适应性，同时适宜的运动强度使心肌的代谢和功能处于良好的状态。这说明心房肌虽然有一定的功能减弱，但是心房肌最终还是功能性增强。在显微镜下所见120 min组心肌细胞处于正常状态，还有微弱的VEGF表达，120 min+负重组中可见心房肌中大量存在有棕黄颗粒，这说明细胞内VEGF mRNA水平明显增加很有可能也主要在心房肌，此结果为运动心脏的形成和心脏康复提供了可靠的试验依据。
参考文献
[1] 艾洪滨，祝建平，张学英，等.长时间游泳对小鼠心电活动的影响[J].山东医学工程，2003，22(1)：24-27.
[2] 步斌.运动负荷与沙棘对大鼠心肌血管内皮生长因子表达影响的研究[J].成都体育学院学报，2004，30(6)：76-79.
[3] 张志琪，田振军，张小玲.不同运动负荷小鼠心肌活细胞游离钙动态变化的LSCM研究[J].中国运动医学杂志，2003，(18)1：201-206.
[4] Stuber M， Scheidegger MB，Fischer S E，et al.Alterations in the local myocardial motion pattern in patients suffering from pressure overload due to aortic stenosis[J].Circulation，1999，100(7)：361-368.
[5] 曲绵域，于长隆.实用运动医学[M].北京：北京大学医学出版社，2003.179-182.
[6] Liu Y， Cox SR， Morita T， et al. Hyooxia regulates vascular endothelial growth factor gene expression in endothelial cell.Identification of a 5’enhance[J].Circ Res，1995，(77)：638-643.
[7] Sellke FW，Wang SY，Stamler A，et al.Enhanced microvascular relaxations to VEGF and bFGF in chronically ischemic porcine myocardium[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，1996，271(8)：713.
[8] Yang R，Thomas GR， Bunting S，et al. Effects of vascular endothelial growth factor on hemodynamics and cardiac performance[J].J Cardiovasc Pharmacol，1996，27：838-844.
[9] Banai S， Shweiki D， Pinson A， et al. Upregulation of vascular endothelial growth factor expression induced by myocardial ischaemia：implications for coronary angiogenesis[J]. Cardiovasc Res，1994，(28)：1176-1179.
[10] 夏云健，时庆德，蒋春笋，等.运动性疲劳状态下大鼠心肌线粒体氧化磷酸化偶联的变化[J].天津体育学院学报，2002，2(19)：19-21.
[11] 刘晓莉，苏美华，乔德才.运动疲劳诱导小鼠心肌细胞氧化应激与DNA损伤[J].中国运动医学杂志，2008，29(5)：621-623.
[12] 关键，王健平，车笑非，等.缺氧条件对成骨细胞VEGF和TGF-β1表达影响的实验研究[J].中国修复重建外科杂志，2008，22(8)：984-988.