【摘要】 NFDEA目的：探讨细菌生物膜在置入导管伴生感染中的作用。方法：对置入性导管于撤除导管时行导管内细菌检查及分离培养，用结晶紫和阿利新蓝染色法对细菌生物膜进行定位及定量检测，分析导管细菌生物膜形成与导管伴生感染的关系。结果：患者置入性导管细菌生物膜阳性率为61.29% (38/62) ，染色技术可用于观察导管内细菌生物膜形成情况。结论：细菌生物膜形成是置入导管伴生感染的重要致病因素，染色技术简便快速，可作为临床快速诊断的方法。
【关键词】 NFDEA生物膜;导管;伴生感染
AbstractNFDEAObjective： To investigate the effect of bacterial biofilm on associated infection of insertion catheter. Methods：The bacteria in insertion catheter were isolated and cultured after removing catheter. The method of staining with Crystal Violet and Alcian Blue was used to localization and quantitation detection of bacterial biofilm. Then the relationship of bacterial biofilm with associated infection of catheter was analyzed. Results：The positive ratio of bacterial biofilm in insertion catheter was 61.29% (38/62). The staining method can be used to observe the formation condition of bacterial biofilm in insertion catheter. Conclusion：The formation of bacterial biofilm was important pathogenic factor in associated infection of insertion catheter. The staining technique was convenient and fast that can be used in clinical fast diagnosis.
Key wordsNFDEAbiofilm; catheter; associated infection
现代医学技术的发展，多种侵入性的医疗器械、生物医学材料广泛应用，如传统的导尿管、子宫节育环、中心静脉导管、新型的人工心脏瓣膜、各种支架、角膜接触镜等，这些器械和材料的应用，在解决了原有医疗问题的同时，许多引发了伴生感染(associated infection)[1]，此种现象在有置入性导管者表现尤为突出有研究发现，细菌容易粘附于塑料输液管内表面，形成细菌生物膜(biofilm)，难以冲洗清除[2]。为了解细菌生物膜与置入性导管伴生感染相关性，我们对医院实施置入性导管进行检查或治疗的患者撤出导管时进行细菌检查、分离培养及生物膜形成的研究，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
2009年7月至2010年6月，采集来自沈阳市多家医院病房患者包括导尿管、呼吸机导管及手术的引流管等标本，共62例(临检已判定有感染，病原菌主要包括铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌)，无菌操作下，将近人体端1cm导管外壁70%酒精涂抹消毒后，纵向剪开，接种环灭菌刮取内壁后接种于LB肉汤培养基中增菌，37℃过夜，然后用其肉汤分别接种于血平板、麦康凯培养基上，可疑鲍曼不动杆菌转种于青霉素·诺氟沙星培养基上培养。
1.2 菌种鉴定
1.2.1 初步鉴定
过夜培养的肉汤直接涂片，革兰染色;平板上可疑菌落触酶试验、氧化酶、甘露醇试验、硝酸盐还原动力试验及明胶酶试验。然后转种相应培养基，纯化。
1.2.2 菌种鉴定及生物膜模式株筛选
经初步鉴定的菌种，采用生物—梅里埃公司ATB生化鉴定分析仪，按ID 32 GN革兰阴性杆菌鉴定试条(Ref. 32 100)、ID 32 STAPH葡萄球菌鉴定试条(Ref. 32 500)及ID 32 C 酵母菌鉴定试条(Ref.32 200)说明书进行鉴定到种。将临床标本中分离纯化的菌株在刚果红培养基培养[3]，产生生物膜的菌株菌落呈深红色，非模式株菌落为无色。
1.3 生物膜形态观察
1.3.1 细菌生物膜染色快速鉴定
根据文献[4]配制生物膜染液：阿利新蓝-刚果红染液：阿利新蓝染液：阿利新蓝2g，冰醋酸3ml，蒸馏水97ml;刚果红染液：刚果红2g，蒸馏水100ml。染色方法：接种环直接刮取导管内壁粘液涂于洁净载玻片上，滴加10μl阿利新蓝染液，混匀，静置3～5 min，火焰加热固定，直至染液挥发完全，滴加20μl刚果红染液，均匀涂布，火焰加热干燥后，三蒸水冲洗，吸干水分后油浸镜(NIKON-80I)下观察。
1.3.2 细菌生物膜形态结构观察
将导管标本分别浸泡于LB肉汤中，封口膜封口防止污染， Innova40温控摇床37℃连续震荡培养，振幅为50Hz，每隔48h取出PBS冲洗，除去浮游菌，换新培养液，鲍曼不动杆菌持续7d，其他菌持续5d。振荡培养后的引流管经2.5%戊二醛4℃下固定24h， pH7.2的磷酸盐缓冲液冲洗3次，再以1%的锇酸4℃固定2h，4℃双蒸水冲洗3次，梯度乙醇脱水(以50%、70%、80%、90%、95%两次、100%三次，每次脱水时间10min)，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，离子喷金镀膜，通过KYKY-3200 SEM扫描观察引流管内壁生物膜形态结构。
1.4 生物膜定量
将刚果红培养基上菌落为深红色的菌种，初步确定形成生物膜的模式株，参照文献[5，6]用微量板进行生物膜定量检测，96孔板于37℃分别培养3d后取出，轻轻拍出孔内液体，然后用PBS缓冲液冲洗四次，去除浮游菌。用1%结晶紫染色15min，三蒸水再次冲洗，待孔板晾干后，向每孔内加入无水乙醇-丙酮(80∶20 v/v)200μl 脱色，置于酶标仪(BioTek ELx800，美国)上测定吸光度(OD570 nm)值。
2 结果
2.1 菌种鉴定
62例导管标本，分离出细菌137株，其中鲍曼不动杆菌43例(31.39%)，铜绿假单胞菌41例(29.93%)，大肠埃希菌22例(16.05%)，葡萄球菌属14例(10.22%)，肺炎克雷伯菌10例，真菌4例(4/137，2.92%)，其它7例(5.11%) ，有11例标本有多种细菌混合感染。ATB生化鉴定菌株：鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌的纯度达99.9%。
2.2 生物膜定性
62例临床标本中有38例在刚果红培养基不同程度菌落呈深红色，为产生生物膜的菌株，阳性率为61.29%。另24例菌在刚果红培养基培养，菌落始终为无色。采用阿利新蓝-刚果红涂片染色，生物膜型细菌因胞外多糖被染成深红色，未成膜的细菌为黄色，背景为蓝色。
2.3 细菌生物膜的定量检测
图1表明微量板上生物膜形成，我们发现颜色最深的孔，恰恰是刚果红培养基上呈深色菌落的模式株。枯草杆菌不形成生物膜为阴性对照，几乎无色。图1 微量板上生物膜形成(紫色孔是生物膜形成菌株，颜色越深表明形成的膜越多)将微量板经过酶标仪测定结果见表1。表1 细菌生物膜的定量检测
2.4 扫描电镜观察结果
导管内表面有膜状物质形成，膜内可见细菌聚集于交联的纤维素样物质中(图2 A)，由于枯草杆菌无胞外多糖，不能形成生物膜，为阴性对照(图2 B)，培养5d的膜厚度可达4.92μm(图2C)。图2 导管内细菌生物膜形态结构(A 导管内形成的生物膜， B 无生物膜形成的对照组，C 培养5d的膜厚度)
3 讨论
本研究发现有感染的患者导管内均有细菌检出，11例患者有多种菌混合感染，病原菌以革兰阴性杆菌为主(116/137，84.67%)，其中铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌是主要致病菌，这些菌均是临床耐药严重的菌株。铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌属于机会致病菌 ，可引起呼吸道、泌尿生殖道感染及败血症等严重感染，其中以呼吸道感染最为常见，本研究62例导管标本中呼吸道感染者44例(70.96%)，如此高感染率，急需快速检测方法进行诊断，我们在研究中采用结晶紫染色方法对细菌生物膜进行定量检测，阿利新蓝染色进行生物膜定位，这些实验技术简便快速，可选为临床快速诊断适宜的方法。扫描电镜可直接观察生物膜的形态特征及结构，但其实验环节多，技术复杂并要求特殊设备，更适用于研究。
患者有侵入性导管操作时，尽管医护人员非常注意无菌技术，但这些患者的医院感染率仍然高于其他患者，以往的报告常限于菌群种类和耐药性分析，而关于这些病原菌如何引起感染少有报道，特别是ICU患者病情重，各种侵入型导管多，这些导管因与外界相通，为细菌粘附提供了机会。本研究发现具有较强粘附性的机会致病菌一旦定植于导管，在导管内的气体或液体的流动冲刷下，容易形成生物膜(38/62，61.29%)。将导管浸入于肉汤培养液中，摇床连续振荡，模拟导管液体流动状态，3天即可形成不易剥离的生物膜，提示这些细菌在医用导管内定植快，易于形成生物膜，尤其是来源于应用呼吸机通气的通气管，鲍曼不动杆菌形成生物膜比率更高，导致ICU患者呼吸道感染鲍曼不动杆菌呈逐年增多趋势。鲍曼不动杆菌在自然环境中普遍存在，具有较强粘附性，属于条件致病菌，置入性导管高感染率的重要原因可能与细菌导管中快速粘附、定植形成生物膜有关[7]，这应引起我们足够的重视。
参考文献
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