GSTP1基因多态性与胃黏膜肠上皮化生的关系

　　　　 作者：王旭光，袁权，张忠，韩莹，王艳宁，韩云飞

【摘要】 目的：了解胃黏膜肠上皮化生(肠化生)人群Pi类谷胱甘肽转移酶基因(GSTP1)不同等位基因的分布，探讨肠化生癌变的内在遗传特性。方法：利用PCRRFLP法检测92例正常人群、55例肠化生组和103例胃癌组GSTP1不同等位基因的分布。结果：与正常对照组相比，具有A/G或G/G基因型者发生肠化生的风险增加到2.075倍(95%CI，0.990～4.348)，　罹患胃癌的风险性增加2.730倍(95%CI，1.380～5.400)。结论：具有A/G或G/G基因型者发生肠化生和胃癌的风险性增加;此种肠化生与胃癌有着相似的遗传特性，可作为癌前肠化生进行随访。

【关键词】 肠化生;多态性;胃癌;人群Pi类谷胱甘肽转移酶基因

　　AbstractObjective：To　analysis　the　distribution　of　polymorphism　of　GSTP1　in　intestinal　metaplasia　(IM)　of　gastric　cancer　，　and　to　assess　the　risk　of　　carcinogenesis　　of　IM.　Methods：Polymerase　chain　reaction　(PCR)　and　restriction　fragment　length　polymorphism　(RFLP)　were　to　analyze　genotype　of　103　gastric　cancer，55　IM　and　92　hospital　controls.Results：　The　subjects　with　A/G　or　G/G　　genotype　　of　　GSTP1　genes　had　an　increased　risk　of　developing　IM(OR：2.075，　95%CI：　0.990～4.348)，　and　gastric　cancer　(OR：　2.730，95%CI：1.380～5.400).Conclusions：Inpiduals　with　GSTP1　A/G　or　G/G　　genotype　show　an　increased　risk　in　developing　IM　and　gastric　cancer.IM　patients　with　A/G　or　G/G　　genotype　have　the　genetic　characteristics　similar　to　those　of　gastric　cancer　，so　they　should　be　regarded　as　highrisk　inpiduals　of　gastric　cancer　and　followed　up　regularly.

　　Key　wordsintestinal　metaplasia;polymorphism;gastric　cancer;GSTP1

　　肠化生是一种常见的胃黏膜病变，经常出现在胃癌发生之前，被认为是胃癌的癌前病变[1，2]。然而，并不是所有的肠化生患者均发展为胃癌，究竟何种肠化生才是可癌变的肠化生，是一个需要明确的问题。以往的研究多着重于肠化生的形态学特性与胃癌的关系，对肠化生患者内在的遗传学特性研究甚少。基因多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型，携带某种多态片段的人群常与某种疾病发病率相关，因此人们通过检测某种基因的多态性来判断某种疾病的易感性。目前发现许多基因的多态性与胃癌易感性相关，其中代谢酶基因多态性与胃癌的关系是近年研究热点。GSTP1是II相代谢酶谷胱甘肽S转移酶(GSTs)家族中一员，人们发现GSTP1第5外显子多态性与胃癌在内的多种肿瘤关系密切[3，4]。但是，GSTP1多态性与肠化生的关系如何尚不清楚。本研究检测正常人群、肠化生和胃癌人群GSTP1第5外显子的多态性，探讨GSTP1是否可以作为预报肠化生癌变的指标。

　　1 对象与方法

　　1.1 对象 本研究选用的病例分别来自2002至2005年辽宁省庄河市中心医院和中国医科大学第一临床医院胃癌筛查者。本研究经中国医科大学伦理委员会批准，以问卷调查和病例记录方法收集所有研究对象的年龄、性别和相关资料，并与患者签署了知情同意书。

　　采集受检者空腹静脉血，分离血清和凝血块后-20　℃保存，凝血块用于GSTP1多态性的检测;同时对患者进行胃镜检查并于胃体、胃角及胃窦和病灶处取胃黏膜，钳取后立即用95%的乙醇固定，然后用石蜡包埋，制成4张5　μm切片，镜检，　进行病理学诊断。本研究选取250例患者进行研究，其中男　154例(61.6%)，女96例(38.4%)，年龄24～84岁，平均年龄(52±12)岁。

　　1.2 方法

　　1.2.1 病理诊断 常规HE染色，经两名病理医生，采用双盲法进行病理诊断，将病例分为正常对照组92例，肠化生组55例，胃癌组103例。

　　1.2.2 DNA提取 从凝血块中提取DNA，用标准的酚-氯仿抽提法[5]。

　　1.2.3 PCRRFLP　检测 依据文献[6]对GSTP1基因(GDB　X08058)第5外显子进行扩增，引物序列如下：正链　5′GTA　GTT　TGC　CCA　AGG　TCA　AG　3′反链　5′AGC　CAC　CTG　AGG　GGT　AAG　3′。反应体系：分别加10×buffer(含MgCl2 25　mmol/L)5μl，dNTP 4μl(浓度)，上下游引物(10pmol/μl)各0.5　μl，Taq　DNA酶0.4　μl，模板DNA　1　μl，加去离子水至总体积50　μl。PCR反应条件：95℃12　min，95℃30s，58℃30s，72℃60s　15个循环;95℃30s，55℃30s，72℃60s 25个循环;72℃5　min，4℃保存。利用BsmA　I限制性内切酶(NBI)对PCR产物置于37　℃恒温箱中进行酶切3　h，然后取酶切产物20　μl，用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色5min后观察DNA条带变化。

　　1.2.4 统计学方法 以χ2检验比较各组基因频率的差异，P&<0.05有统计学意义。以比值比(OR)及其95%可信区间(CI)表示各基因型发生不同疾病的风险。OR值以非条件Logistic回归计算。所有统计检验均为双侧概率检验。统计分析采用SPSS11.5软件进行分析。

　　2 结果

　　2.1 GSTP1基因105位点A/G多态图谱 第5外显子A→G碱基改变可导致蛋白质肽链第105位点氨基酸由ATC异亮氨酸(Ile)变为GTC缬氨酸(Val)。经限制性内切酶酶切后，GSTP1出现3个分子量不同的酶切片断，分别是329　bp，222　bp，107/104　bp，呈现3种图谱改变(图1)，第1种为A/A纯合子，具有329　bp和107　bp/104　bp等位基因片段;第2种为A/G杂合子改变，具有329　bp，222　bp，107/104　bp等位基因片段;第3种为G/G纯合子突变型，具有222　bp，107/104　bp等位基因片段。

　　图1 PCR扩增的GSTP1基因片断经BsmA　I限制性

　　酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱GSTP1基因经BsmA　I酶切后出现3个分子量不同的等位基因片断，分别是329　bp，222　bp，107/104　bp　，M泳道为DNA　marker　(DL2000);2，3，5，7，9-12　泳道为A/A　纯合子基因型;4，6泳道为A/G杂合子基因型;1泳道为G/G纯合子基因型，8泳道为阴性。

　　2.2 不同疾病组GSTP1基因型频率的分布 由于G/G基因型检出率很低，将A/G和G/G基因型和为一组　与A/A基因型进行比较。Logistic多因素分析结果显示，经性别年龄调整后，肠化生组和胃癌组A/G和G/G基因型频率显著升高。具有A/G或G/G基因型者发生肠化生的风险增加到2.075倍(95%CI，0.990～4.384)，发生胃癌的风险性增加2.730倍(95%CI，1.380～5.400)，见表1。表1 不同疾病GSTP1基因型频率比较

　　3 讨论

　　胃癌的发生是内在遗传因素和外在环境因素共同作用的结果，肠化生是胃癌发生之前的重要环节，同样也受到内外因素的影响。个体对环境致癌物的代谢不仅有Ⅰ相代谢酶的参与，Ⅱ相代谢酶也同样发挥着重要的作用。I　相代谢酶主要对外来化合物进行生物转化，　II相代谢酶则对Ⅰ相反应代谢活化所产生的亲电子中间体与体内的化合物进行结合反应。GSTs属Ⅱ相代谢酶，　能催化亲电子致癌物与谷胱甘肽结合，　形成易溶于水的化合物排出体外，　是与毒物或致癌物解毒代谢有关的酶类。除此之外，GSTs还具有对其他酶或蛋白的调节作用，　参与DNA的修复，　因而GSTs有助于维持细胞基因组的完整性，他们的变异和多态性会影响到个体对肿瘤或某种疾病的易感性。迄今为止，研究发现GSTs存在于多种物种组织中，　在消化系统上皮组织中相对较多。在正常胃黏膜中，GSTP1是重要的一种GSTs亚型，　主要参与烟草中致癌物的代谢。GSTP1基因编码的酶可催化一系列底物亲电子中心与还原型谷胱甘肽轭合，　从而在外源化合物的代谢过程中起重要作用。

　　第1期王旭光等.GSTP1基因多态性与胃黏膜肠上皮化生的关系··

　　正因为GSTP1与外源性致癌物代谢密切相关，人们开始对其基因多态性进行了广泛的研究，发现该基因存在两个多态性位点，一个是第5　外显子1587对碱基处A→G，导致Ile(异亮氨酸)-105→Val(缬氨酸)，另一个是第6外显子2293对碱基处C→T，导致　Ala(丙氨酸)-114→Val。研究显示GSTP1第5外显子与乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肺癌和慢性阻塞性肺疾病[7-13]等多种疾病的发生有关。因此本研究检测GSTP1基因第5外显子的多态性与肠化生的关系，来寻找可癌变肠化生内在的遗传证据。

　　正常对照组、肠化生组和胃癌组GSTP1第5外显子不同基因型分布频率。结果显示，正常组以A/A基因型为主，肠化生组和胃癌组以A/G和G/G基因型为主;肠化生和胃癌组A/G和G/G基因型频率高于正常对照组。结果提示，具有A/G或G/G基因型者发生肠化生和胃癌的风险性增加。具有A/G或G/G基因型者因碱基发生A→G置换，使其编码的蛋白质由异亮氨酸(Ile)变为缬氨酸(Val)，进而热稳定性及其他功能也发生了改变，有研究证实位于第105位点氨基酸的替代改变了氨基酸的体积和疏水性，从而影响了酶的热稳定性。还有文献报道GSTP1酶-　Val105(含G等位基因)的热稳定性比GSTP1酶-　Ile105(不含G等位基因)的低2～3倍[14]。因此，GSTP1编码蛋白质功能的改变，使机体对外界的解毒功能降低，推论当具有A/G或G/G基因型的个体在受到外界损伤后，机体对抵抗外界致癌物损伤的能力降低，从而更易被损伤，黏膜的结构遭到破坏，即具有了发生肠化生和胃癌的遗传基础。此种肠化生可作为癌前肠化生进行随访。

参考文献

　[1]Kang　KP，　Lee　HS，　Kim　N，et　al　.　Role　of　intestinal　metaplasia　subtyping　in　the　risk　of　gastric　cancer　in　Korea[J].J　Gastroenterol　Hepatol，2009，24：140-148.

　　[2]Holmes　K，　Egan　B，　Swan　N，et　al　.　Genetic　mechanisms　and　aberrant　gene　expression　during　the　development　of　gastric　intestinal　metaplasia　and　adenocarcinoma[J].　Curr　Genomics，2007，8：379-397.

　　[3]Katoh　T，　Kaneko　S，　Takasawa　S，　et　al.Human　glutathione　Stransferase　P1　polymorphism　and　susceptibility　to　smoking　related　epithelial　cancer：　oral，lung，　gastric，　colorectal　and　urothelial　cancer[J].　Pharmacogenetics，　1999，　9：　165-169.

　　[4]ZHANG　Ye，　SUN　LiPing，　CHEN　Wei，et　al　.A　molecular　epidemiological　study　on　the　relationship　between　the　polymorphism　of　GSTP1　and　susceptibility　to　gastric　cancer　in　northern　Chinese[J].　Yichuan　，2007，29：293-300.

　　[5]Sun　LP，Guo　XL，Zhang　Y，et　al.　Correlation　between　an　insertiondeletion　polymorphism　in　the　pepsinogen　C　gene　and　gastric　cancer　as　well　as　its　precursors[J].Natl　Med　J　China　，2006，(86)：3059-3063.

　　[6]Ishii　T，　Matsuse　T，　Teramoto　S，et　al.　Glutathione　Stransferase　P1　(GSTP1)　polymorphism　in　patients　with　chronic　obstructive　pulmonary　disease[J].　Thorax，　1999，54：　693-696.

　　[7]Van　Emburgh　BO，　Hu　JJ，　Levine　EA，et　al.　Polymorphisms　in　CYP1B1，　GSTM1，　GSTT1　and　GSTP1，　and　susceptibility　to　breast　cancer[J].Oncol　Rep，　2008　，19：1311-1321.

　　[8]Leichsenring　A，　LosiGuembarovski　R，　Maciel　ME，　et　al.　CYP1A1　and　GSTP1　polymorphisms　in　an　oral　cancer　casecontrol　study [J].　Braz　J　Med　Biol　Res，　2006，39：1569-1574.

　　[9]Chen　K，　Jiang　QT，　He　HQ.　Relationship　between　metabolic　enzyme　polymorphism　and　colorectal　cancer [J].World　J　Gastroenterol，2005，11：331-335.

　　[10]Agalliu　I，　Langeberg　WJ，　Lampe　JW，　et　al.　Glutathione　Stransferase　M1，　T1，　and　P1　polymorphisms　and　prostate　cancer　risk　in　middleaged　men [J].　Prostate，　2006，　66：146-156.

　　[11]Sobti　RC，　Kaur　S，　Kaur　P，　et　al.　Interaction　of　passive　smoking　with　GST　(GSTM1，　GSTT1，　and　GSTP1)genotypes　in　the　risk　of　cervical　cancer　in　India [J].Cancer　Genet　Cytogenet，　2006，166：117-123.

　　[12]Sreeja　L，　Syamala　V，　Hariharan　S，et　al.　Glutathione　Stransferase　M1，　T1　and　P1　polymorphisms：　susceptibility　and　outcome　in　lung　cancer　patients [J].J　Exp　Ther　Oncol，　2008，7：73-85.

　　[13]Vibhuti　A，　Arif　E，　Deepak　D，et　al　.　Genetic　polymorphisms　of　GSTP1　and　mEPHX　correlate　with　oxidative　stress　markers　and　lung　function　in　COPD [J].　Biochem　Biophys　Res　Commun，2007，359：136-142.

　　[14]Watson　MA，　Stewart　RK，　Smith　GB，　et　al.Human　glutathione　Stransferase　P1　polymorphisms：　relationship　to　lung　tissue　enzyme　activity　and　population　frequency　distribution [J].　Carcinogenesis，　1998，19：　275-280.