干细胞治疗脊髓损伤的研究进展

【关键词】 干细胞;脊髓损伤;治疗

目前对于脊髓损伤(spinal　cord　injury，SCI)的临床治疗主要是通过手术稳定当前的受损部位，大剂量的皮质类固醇能够帮助限制继发性损伤和术后的康复训练;神经保护剂(如米诺环素，Rho抑制剂，Cethrin等)的临床试验也即将开始。虽然这些治疗方案可以有一定的效果，但仍面临许多患者重要的神经功能障碍和残疾。随着研究的不断深入，干细胞已经逐步应用到了SCI的治疗中，但是也有很多障碍包括：确定干细胞的最佳来源细胞，移植之前优化其特点，减少干细胞疗法的风险，发展大型制造技术，并实现管理等都需要考虑政府批准[1]。本文就近年来关于干细胞治疗SCI的研究进展综述如下。

　　1 脊髓损伤的病理特征

　　移植干细胞并不能够实现完全SCI后功能恢复。SCI主要病理特征是炎症损伤的发生，逐步出血性坏死，水肿，脱髓鞘和细胞的破坏。在SCI的早期阶段，有血管的破坏，灰质内神经元丧失和轴突髓鞘损伤，细胞死亡会导致兴奋中毒进一步加重损伤。谷氨酸在细胞外液聚集，从而导致过度活跃的神经递质受体。高浓度的钙进入细胞并激活酶(磷脂酶，蛋白酶等)破坏细胞结构。这种细胞损伤和其他变化常常导致细胞死亡(凋亡)和自由基脂质过氧化[2]，这些都可能对移植细胞造成损害。巨噬细胞，中性粒细胞和T细胞迁移到外周循环，小胶质细胞(通常居住在脊髓)也被激活。小胶质细胞和巨噬细胞活化通过吞噬功能去除死细胞和碎片。因此，无论是SCI炎症早期还是慢性阶段都可能损害移植细胞。

　　经过初期的伤害，破坏逐步扩展，部分较外部白质未被广泛破坏而更多的脊髓内灰质破坏加重，由于少突胶质细胞的轴突损失和脱髓鞘进一步加重。脱髓鞘脊髓损伤是一种持久不变的损伤[3]，星形胶质细胞反应开始出现(增殖，肥大等)，产生活性细胞外基质成分如硫酸软骨素和角质蛋白多糖，最终胶质瘢痕产生，这既是一种物理性屏障也为轴突再生提供了环境[4]。

　　因此，干细胞治疗SCI可能有必要在短暂治疗窗(急性炎症和前胶质瘢痕形成)内移植才能有效[5]。

　　2 干细胞的来源和分类

　　根据干细胞的来源和基本特征的不同，主要可分为两种类型：胚胎干细胞和组织干细胞。胚胎干细胞是指来源于早期胚胎组织，具有高度自我更新和多向分化潜能的未分化细胞。包括3种类型：胚胎干细胞(embryonic　stem　cells，ES细胞)、胚胎生殖干细胞(embryonic　germ　cells，EG细胞)及畸胎瘤干细胞(embryonic　carcinoma　cells，EC细胞)。成体的许多组织和器官，如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力，未分化的细胞在其中起着关键作用。这种存在于已分化组织中的未分化细胞便是成体干细胞。多能成体干细胞只有来自早期胚胎的干细胞才具有全能的分化能力，这是目前大多数干细胞研究者所作出的结论。

　　(1)神经干细胞(neural　stem　cells) 神经干细胞移植治疗SCI机制：①神经干细胞分化后产生的神经元和神经胶质细胞可以分泌多种神经营养因子，改善脊髓局部微环境并启动再生相关基因的顺序表达，使得损伤轴突开始再生[6]。②产生多种细胞外基质，填充SCI后遗留的空腔，为再生的轴突提供支持物[7]。③补充外伤后缺失的神经元和胶质细胞。④使残存脱髓鞘的神经纤维和新生的神经纤维形成新的髓鞘，保持神经纤维功能的完整性。

　　LópezToledano等[8]研究了El5大鼠纹状体分离出来的表皮生长因子扩增神经干细胞的成纤维细胞生长因子受体表达，发现了受体的发育相关性表达形式和细胞系特异性分布。在许多早期前体细胞和少突胶质细胞谱系可识别出成纤维细胞生长因子受体1和受体2。用碱性成纤维细胞生长因子处理神经干细胞的后代能增加前体细胞的增殖率和少突胶质细胞的数量，但分化神经元的数量大大减少。Biernaskie等[9]认为由室管膜细胞产生的Noggin，可以阻止B型细胞的骨形态发生蛋白自分泌信号，从而产生一个邻近侧脑室的脑室下区的神经发生环境，促使室下区星形胶质细胞沿神经元谱系分化。干细胞存在的微环境还含有不同的细胞类型，提供机械的或营养的支持。中枢神经系统辐射状胶质细胞在早期脑发育中为神经元迁移提供支持作用，为神经元存活、增殖和分化提供神经营养信号。

　　(2)胚胎干细胞(embryonic　stem　cells，ESCs) ESCs的发现是克兰史密斯和皮尔斯(1964)的早期工作。他们证明，单个胚胎细胞对自我发展有更新能力，并生成多种成熟细胞类型。ESCs可以从预先准备植入或胚泡阶段的胚胎(从创建的过程中未使用的胚胎体外受精的程序)，通过体细胞核移植。不同于一般的体细胞，ESCs可以几乎无限数量的增长，因为他们不经过衰老，保持高活性和正常细胞周期，他们不进行基因组，线粒体和表观遗传变化。

　　杨建华等[10]将ESCs行3～4次传代后利用全反式维甲酸(retinoic　acid，RA)进行诱导并培养，采用RTPCR法对诱导后的ESCs衍生细胞行巢蛋白(Nestin)、微管相关蛋白2等神经干细胞(neural　stem　cells，NSCs)及神经细胞特异标志物检测，发现上述均有表达;将细胞植入小鼠SCI处后观察发现，小鼠后肢功能得到明显改善，XGal染色示阳性细胞向SCI远端迁移5　mm以上，而且XGal染色阳性细胞表达神经元特异标志神经营养因子(neurotrophic　factor，NF)。基因工程的应用使干细胞应用前景更加广阔。但Howard等[4]将鼠来源的ESCs进行基因修饰，使其表达抗凋亡蛋白Bcl2，再分别给SCI大鼠行经过基因修饰的ESCs移植。6周后发现，治疗组与对照组后肢运动功能BBB评分均无明显改善，在行基因修饰细胞移植的大鼠SCI部位还发现了未分化的细胞团块，这也表明了经基因修饰的ESCs有致瘤性这一不稳定因素。越来越多的研究表明[3，11]，人类ESCs可以向定向中枢神经系统方向分化为高纯度及高浓度的神经细胞及其他种类细胞。但目前也有观点认为，未经鉴定以及调控的ESCs移植致瘤性很高，不适于移植，随之带来的免疫反应及神经性疼痛也备受关注。

　　(3)嗅鞘细胞(olfactory　ensheathing　cells，OECs) OECs移植被认为是修复SCI最有前景的方法之一。OECs同时具有SCs和星形胶质细胞的特征，可以伴随嗅神经的轴突进入中枢神经系统，并引导轴突终端与嗅球的相应部位建立功能性联系，Ramon　Cueto等[12]报道OECs移植进大鼠完全损伤的脊髓平面，能促进皮质脊髓束中的去甲肾上腺素能和5羟色胺能神经纤维的长距离再生，跨越SCI平面与远段脊髓相联系，并且再生的轴突周围有髓鞘碱性表达;同时观察到实验动物的感觉和运动功能均有明显的恢复。Barnett等[13]回顾分析了大量的OECs移植的相关文献，发现大部分文章的报道结果令人振奋，但不同的实验室应用的细胞采集和培养技术和动物模型建立的方法均不一样，难以得到一个较为客观和统一的结论。另外，仍有相当多的问题需解决，如OECs的取材、培养、纯化等方面条件要求严格，体内移植要求时间长，OECs移植后长入远侧脊髓的轴突数量和质量离临床实际应用的要求还有相当大的一段距离。最近，Lee等[14]应用核磁共振的方法对OECs在体内的迁移情况进行了观察，发现移植在大鼠损伤脊髓2个月后的OECs的迁移范围十分有限，没有观察到OECs能跨越横断损伤的脊髓部位，认为在脊髓横断损伤后，特别是在胶质瘢痕形成后，移植的OECs不能通过损伤的脊髓平面，在损伤脊髓中的迁移能力和修复损伤的能力有限。尽管如此，不少国家，包括我国在内，已经将OECs移植应用到临床研究中去，以评价其临床有效性和安全性，相信不久的将来，OECs移植重建脊髓功能会有一个更为严格和客观的结论。

　　(4)内源性干细胞及前体细胞(endogenous　stem　cells　and　progenitors) 内源性干细胞主要存在于齿状回与室管膜下区(subventricular　zone，SVZ)。中枢神经系统损伤后参与修复的内源性干细胞主要来源于静息状态的干细胞被激活及成熟神经细胞逆向分化，但其实际替代作用及神经元再生非常有限，这可能与一些因素限制了内源性干细胞、前体细胞及成熟神经元的再生功能有关，其中包括胶质瘢痕形成、缺乏NF、硫酸蛋白聚糖的抑制作用及环磷酸腺苷(cyclic　adenosine　monophosphate，cAMP)水平下降等。

　　如何激活内源性干细胞系，使其增殖、分化，再进入细胞循环更好地发挥修复作用，是备受关注的问题。Cooper等[15]向帕金森病模型大鼠纹状体内注射TGFα，发现可明显促进内源性干细胞的增殖，并且发现从SVZ向外迁移出大量的Nestin阳性前体细胞，但是这些细胞保持着未分化状态，无任何神经元分化表现。Espinosajeffrey等[16]将TS1(人IGF1与转铁蛋白Tf重组而成)注射入野生型髓鞘发育缺陷的大鼠模型胼胝体内，注射后发现其脑内表达NSCs标志物Nestin、NF以及胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial　fibrillary　acidic　protein，GFAP)，在SVZ也发现了新生的OLs，并且细胞量与Tf表达成正相关。此外，近年有研究指出促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)及其受体EPOR、微染色体维持蛋白、调控Notch信号途径均可促进内源性干细胞增殖分化，增加神经表型细胞生成。Nistor等[17]发现hESCs在体外培养过程中可人为干预使其分化为高纯度的OLs前体细胞，将其移植入脊髓撞击伤大鼠模型后，可以分化为成熟的OLs，改善再髓鞘化程度及运动功能。相对于成人中枢神经系统损伤后神经元的再生功能，胶质细胞在伤后也有增殖的情况。轴突再生失败不是因为轴突本身无再生能力，而是由于其生长的微环境受到抑制。

　　3 干细胞治疗的临床应用及展望

　　SCI的干细胞移植修复的研究进展较快，其内部机制也得到了进一步认识，但将干细胞移植真正过渡至临床试验阶段甚至人体试验，均必须面对一个问题，即“过程控制”：干细胞及其他所有相关准备材料必须有可以追踪及鉴定的技术支持及安全的材料来源;所有的实验试剂必须有质量控制及保证;干细胞要保证避免逆转录病毒及感染病原的干扰;染色体核型分析技术要保证干细胞无其他遗传变异。在细胞移植治疗方案实施于人体之前，一定要提前评估可能会带来的反面效应，其中应包括致瘤、免疫反应、疼痛及因移植细胞与宿主表型不同而带来的一系列变化。再者，合适的细胞移植的时间和途径，更理想的转基因载体和更有效的转染方法等仍需进一步探索。各种移植细胞的定向调控仍然需改进。轴突的再生及其与远侧神经细胞的联系方式仍然未知。相信随着相关研究的深入，这些问题也会进一步解答，SCI治疗的效果能够得到进一步提高。

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