【摘要】 目的： 对牙体脱钙和劈牙取髓法在牙髓血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)免疫组织化学研究中的染色效果进行比较，初步探讨牙体脱钙技术在牙髓免疫组织化学研究中的应用。方法： 取因正畸治疗需要而拔除根尖孔完全闭合的健康下颌前磨牙30颗，分别通过牙体脱钙和劈牙取髓制作牙体牙髓联合切片和牙髓切片，进行VEGF免疫组织化学染色，在显微镜下观察两者的染色效果和组织结构特点。结果： 牙体脱钙法制得的牙体牙髓联合切片组织染色效果良好，牙髓细胞、成牙本质细胞、牙本质小管结构清晰，VEGF阳性染色空间分布定位明确;劈牙取髓法制得的牙髓切片成牙本质细胞残缺不全，组织厚薄不一，染色对比度差。结论： 牙体脱钙技术应用于牙髓免疫组织化学研究的组织染色效果良好、结构清晰，能够保全牙髓组织。
【关键词】 脱钙技术; 牙髓; 血管内皮生长因子
[Abstract] Objective: To compare immunohistochemical staining results of vascular endothelial growth factor (VEGF) in human dental pulp by decalcification and splitting teeth and explore the application of decalcification in immunohistochemical study of human dental pulp. Methods： Thirty healthy and mature mandibular premolars were collected for orthodontic reasons and studied with VEGF immunohistochemistry staining respectively by decalcification and splitting teeth， produced two different dental pulp sections and to observe the staining results between the two methods under the microscope. Results： Sections processed with decalcification worked well， in which pulp cells， odonoblasts and dentinal tubule structure were clear and VEGF positive distribution were well defined; While， sections dealt with splitting teeth were with incomplete odonoblasts， poor staining and weak contrast. Conclusion： Decalcification applicated in dental pulp immunohistochemical study can keep structure clear， preserve experiment results objective and is well recommended.
[Key words] decalcification; human dental pulp; vascular endothelial growth factor
在牙体牙髓研究领域，采用显微镜观察牙髓组织特定染色切片为最常见的研究手段之一。牙髓是一种与牙体营养、感觉、防御及修复功能密切相关的疏松结缔组织，位于坚硬的牙体中央[1]。牙体硬组织内含有大量的无机盐成分，坚硬致密且难切易碎;而位于牙体中央的牙髓则是柔软，易受挤压和牵拉变形的结缔组织。传统研究主要通过劈牙获取牙髓，即所谓的劈牙取髓法。现在，随着脱钙技术的成熟，通过牙体脱钙制备牙体牙髓联合切片对牙髓进行相关研究逐渐引起人们的关注。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，不仅与组织器官生长发育密切相关，还参与炎症、创伤愈合及缺血性组织修复等。研究恒牙牙髓组织VEGF的表达，将有助于为临床髓病治疗术式的选择提供新思路[2]。
1 材料和方法
1.1 病例选择和实验分组
牙体标本取自因正畸治疗需要而拔除、根尖孔完全闭合的健康下颌前磨牙。供者年龄15～21岁，平均17岁，取其左右下颌前磨牙各一颗。所有研究对象均无全身系统性疾病，近3个月未曾服用免疫抑制剂和抗生素。将新鲜拔除的牙体分为两组，Ⅰ组：左侧下颌前磨牙15颗，劈牙取髓制作软组织切片;Ⅱ组：同一供体的右侧下颌前磨牙15颗，牙体脱钙制作牙体牙髓联合切片。
1.2 标本制备
经患者同意，牙体拔除后去尽牙周软组织，生理盐水洗净。Ⅰ组：牙体置于垫有无菌纱布的台面上沿发育沟劈开，探针小心剥离牙髓组织，并将牙髓上残留的硬组织碎片剔除干净，生理盐水漂洗，10%甲醛固定，冲洗，常规脱水，透明，石蜡包埋。每个标本于牙髓长轴最大体积处连续取完整3张切片，厚约4 μm，分别用于HE染色，免疫组织化学染色及阴性对照。Ⅱ组：10%甲醛固定离体牙，3天后取出流水冲洗，金刚砂高速涡轮机沿牙体外形均匀磨除，直至透过牙体硬组织可清晰看见完整的髓腔形态，牙体冠根等厚(约3 mm)再固定1天确保牙髓充分固定。取出薄块，流水冲洗，浸泡于EDTA快速脱钙液(购于中杉试剂公司，产品编号ZLI9325)，37 ℃培养箱中脱钙。待牙体软至扩大针可无阻力穿通时取出，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。切片时，刀刃与组织包埋块成5°角，自牙根切向牙冠，匀速慢行，厚约5 μm。每个标本取3张，用于HE染色，免疫组织化学染色及阴性对照。
1.3 免疫组织化学染色
免疫组化SP法进行VEGF抗体染色。其中兔抗人VEGF单克隆抗体，免疫组织化学SP检测试剂盒均购于中杉试剂公司;PBS液代替一抗作为阴性对照，阳性对照为中杉试剂公司提供的阳性对照片。染色主要过程：组织切片常规脱蜡，水化，3% h3O2 阻断内源性过氧化物酶，VEGF 抗体滴加，DAB显色，水洗，复染和透明，最后中性树胶封固，4℃保存。以胞质和基质染成连续条索状，斑点状或颗粒状棕黄色为阳性染色。
1.4 图像分析和数据统计
光镜下(×400)，分别对两组切片进行牙髓成纤维细胞计数，每张切片随机选取6个视野，取平均值;利用倒置成像系统和ImagePro Plus 6.0图像分析软件，对各组成纤维细胞阳性染色部位的平均光密度值(mean optical density， MOD)进行定量分析;采用SPSS15.0软件包对两组成纤维细胞总数、阳性染色数及其MOD分别进行成组设计资料的t检验。
利用镜下标尺将牙体牙髓联合切片中牙髓由冠到根均分成3个区段，依次为冠1/3，中1/3和根尖1/3。见图1。高倍镜下(×400)，各部分各随机取5个阳性染色视野，选取同张切片的空白区进行校正，分别测量MOD，取其平均值。用SPSS15.0软件作统计分析，对3部分的MOD均值进行单因素方差分析。A：冠1/3;B：中1/3;C：根尖1/3牙髓图1 牙体联合切片牙髓分区
2 结 果
2.1 染色效果、组织结构及操作时间的比较
Ⅱ组切片中，组织染色对比度强，牙髓细胞、成牙本质细胞、血管和牙本质、前期牙本质以及牙本质小管等结构清晰可见且各层次过渡明显，易于区分(图2-3)。Ⅰ组切片中，牙髓组织不全，根髓常缺失或与其他牙髓重叠，可以发现各部分组织有不同程度的相互交错，且成牙本质细胞层的完整性破坏严重，几乎不能显示成牙本质细胞层，尤其在牙髓根尖狭窄部位牙髓组织有明显的撕脱现象(图4-5)。在操作时间上，Ⅰ组1～2 d可完成HE染色，整个操作过程简单快捷;Ⅱ组需5～7 d才能完成联合切片的染色，除常规HE操作步骤外，还需对牙体进行预备、二次固定和脱钙。图2 脱钙法牙髓纵断切片(HE×100)d：牙本质;pr：前期牙本质;od：成牙本质细胞;pc：牙髓细胞图3 牙体脱钙联合切片(HE×20)图4 劈牙法牙髓纵断切片(HE×100)图5 劈牙法牙髓切片(HE×20)
2.2 牙髓中成纤维细胞的相关比较
牙髓VEGF免疫组织化学阳性染色可表达于牙髓细胞、间质细胞和血管内皮细胞，其中血管内皮细胞中呈条索状强阳性染色(图6)，在牙髓及间质细胞中呈颗粒或斑片样表达。染色强度与MOD成正比。图6 牙体联合切片牙髓VEGF阳性染色(SP×20)镜下观察，Ⅱ组切片中牙髓成纤维细胞数多且沿髓腔壁带状分布，Ⅰ组切片中牙髓成纤维细胞数少，分布不连续呈撕脱样排列。对两组一定面积内成纤维细胞总数、阳性细胞数及MOD分别进行两样本t检验，显示Ⅱ组单位面积成纤维细胞总数、阳性细胞数及MOD均多于Ⅰ组，前两者差异有统计学意义，而MOD却无统计学意义。见表1。表1 两组牙髓中VEGF阳性表达的成纤维细胞数
2.3 不同部位牙髓组织的VEGF表达比较
由于Ⅱ组牙髓组织保存完整，可进一步对其自冠髓到根髓VEGF的表达进行对比，单因素方差分析结果表明成熟牙髓冠1/3，根中1/3和根尖1/3的VEGF表达无明显差别，呈均一、稳定性表达(F=2.034，P&>0.05)，见表2。表2 成熟恒牙不同部位牙髓组织的平均光密度值
3 讨 论
本实验结果表明，在牙髓VEGF免疫组织化学观察研究中，应用牙体脱钙技术制作联合切片，组织染色良好、结构清晰、阳性表达空间定位明确。与传统劈牙取髓法相比，制作牙体牙髓联合切片可获得相对完整的牙髓组织，避免了成牙本质细胞层及根髓残留于髓腔壁和组织标本损伤，有利于不同部位组织的辨认和定位，能较客观真实地再现活体内牙髓的全貌。研究发现，脱钙组牙髓单位面积成牙本质细胞总数多于劈牙取髓组，且对牙髓不同区段VEGF阳性染色的平均光密度值进行比较，显示VEGF均一表达于成年牙髓的不同部位。Mantellini等[3]认为随着年龄增长，不断缩小的髓腔可予牙髓各部均一的压力促其适量表达VEGF以适应牙髓增龄性的变化，这或许可用于解释恒牙根尖发育完成后牙髓VEGF在各区段的表达无明显差异，与牙根发育未完成前VEGF在各区段的表达不尽相同。另外，劈牙取髓法制得的牙髓切片成牙本质细胞残缺不全，组织厚薄不一，不能很好地区分冠1/3，中1/3和根尖1/3的牙髓，很难客观准确地定位不同区段VEGF的表达。至于两种方法显示总的MOD值没有显著性差异可能与劈牙取髓法中牙髓组织有不同程度的相互交错重叠有关。
由于联合切片保留了牙体的硬组织，组织的充分固定和硬组织的安全脱钙是后续染色成功的关键。实验中，考虑牙体硬组织坚硬致密，固定液通过根尖孔进入牙髓很难达到充分、均匀的固定，为此，实验把拔除后的新鲜离体牙先进行预固定，再将其备成冠根等厚的薄片进行二次固定并脱钙，这样既避免了备牙时对牙髓的不良刺激，又加快了脱钙进程，预防长时间固定后组织变硬并且有利于切片的制作。
除保证软组织有效固定外，联合切片的制作过程中在确保软组织不受破坏的前提下，还须保证硬组织得以彻底脱钙。因为硬组织脱钙不完全容易导致切片破碎，而脱钙过度又会破坏软组织的形态结构和成分性质，最终造成染色不佳甚至染色失败。目前，常用的脱钙液主要有单酸类、混合酸类和螯合剂类。本实验所用脱钙剂的主要成分为乙二胺四乙酸(EDTA)，属螯合剂类脱钙剂。有学者通过对3类脱钙液脱钙效果的分析比较，证明EDTA在组织脱钙中具有对组织破坏极小、染色效果好、细胞形态清晰可见且能保持组织细胞完整结构等明显优势。但EDTA用于脱钙的不足在于：脱钙速度慢且脱钙后组织会稍微变硬[4-5]。尽管如此，该技术仍然值得进一步探讨和优化，若综合其他脱钙方法将会更加完美。如在一定温度范围内，搅拌、微波、超声等的应用都是提高脱钙效率的重要措施[6]。
总之，劈牙取髓虽然简便快速，但不适用于需要对牙髓不同部位进行比较的研究实验，因为牙髓根尖狭窄部位在剥离时很容易断裂，镜下组织撕脱表现明显。牙体脱钙技术的引入虽然使牙髓免疫组织化学研究变得繁琐，但其具有组织保存完整、染色效果良好、细胞形态清晰和实验结果较传统劈牙取髓客观真实等优势，值得推荐。
参考文献
[1] Kim S， Liu M， Simchon S， et al.Effects of selected inflammatory mediators on blood flow and vascular permeability in the dental pulp[J]. Proc Finn Dent Soc，1992，88(1):387-392.
[2] 王双义，苏丽萍，曹建明，等.血管内皮生长因子在口腔颌面骨组织工程中的应用[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(14):2741-2744.
[3] Mantellini MG，Botero T，Yaman P， et al. Adhesive resin and the hydrophilic monomer HEMA induce VEGF expression dental cells and macrophages[J]. Dent Mater，2006，22(5)：434-440.
[4] 姚丽艳，赵 伟，吕红兵.3种脱钙液对牙体牙周联合切片HE染色效果的对比[J].福建医科大学学报，2006，40(3)：298-301.
[5] 黄美雅，黄云梅，林燕萍，等. EDTA 脱钙方法的实验观察[J].福建中医药，2007，38(4)：46-47.
[6] 王亚红，蒋 勇.牙及牙周组织联合切片制作技术现状与进展[J]. 中国实用口腔科杂志，2008，1(12):747-749.