含KSHV vIL6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定

【摘要】 　　目的： 在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi′s sarcomaassociated herpesvirus，KSHV）vIL6基因，并进一步纯化和鉴定表达蛋白。方法： 以本实验室已构建的重组质粒pGEX6p1vIL6为模板，PCR扩增目的基因片段，将PCR产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中，构建vIL6的重组原核表达质粒pET32a(+)vIL6。将重组质粒转化大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3）感受态细胞，用异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白。表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定。结果： 限制性内切酶检测和基因测序证实，成功构建了含有vIL6基因的原核表达载体。蛋白质印迹法结果显示，在大肠埃希菌BL21(DE3)中HisTag融合蛋白得到了表达，亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL6融合蛋白。结论: 重组质粒pET32a(+) vIL6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达，利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白。

【关键词】 病毒白细胞介素6基因； 原核表达； 融合蛋白； 卡波济肉瘤相关疱疹病毒

　　［Abstract］Objective: To construct the prokaryotic expression vector carrying KSHV vIL6 gene and purify the fusion protein in E.coli.Methods： The DNA fragment of the vIL6 gene from pGEX6p1vIL6 was cloned into the prokaryotic expression vector pET32a(+)， named pET32a(+) vIL6. Then the recombinant vector was transformed into E.coli BL21(DE3). The expression of the histidinetagged(HisTag) fusion protein was induced with isopropylβDthiogalactopyranoside(IPTG). The fusion protein was detected and purified by western blot and the immobilized Ni2+ absorption chromatographic column， respectively. Results: The prokaryotic expression vector carrying vIL6 gene was successfully constructed. The expression of the HisTag fusion protein in E.coli BL21(DE3) was detectable. Finally， the vIL6 fusion protein with the relative molecular weight of 43 000 was got after purified using the affinity chromatographic column. Conclusion: Recombinant vIL6 can be expressed in E.coli BL 21(DE3) and the fusion protein can be obtained.

　　［Key words］viral interleukin6; prokaryotic expression; fusion protein; Kaposi′s sarcomaassociated herpesvirus(KSHV)

　　卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi′s sarcomaassociated herpesvirus，KSHV）又称人类疱疹病毒8型（human herpesvirus 8，HHV8），1994年由美国哥伦比亚大学病理学家Chang等［1］采用代表性差异分析法（representational different analysis）首先在卡波济肉瘤组织中发现。KSHV感染与三种疾病密切相关：卡波济肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphomas）和多中心卡斯特莱曼病（multicentric Castleman′s disease），而KSHV基因组编码的病毒白细胞介素6（viral interleukin6， vIL6）在其中发挥着重要的作用［2］。KSHV的生命周期分为潜伏感染期和裂解复制期［3］。vIL6是由KSHV裂解复制期基因K2编码的多功能细胞因子。我们先前将vIL6克隆在pGEX6p1载体中，考虑到用pGEX6p1表达的蛋白融合了一个GST，GST蛋白较大，作为免疫原制备vIL6抗体时会增加无关的表位，为此，本研究选用pET32a(+)载体，在重组载体多克隆位点的上游有一编码6个组氨酸的HisTag序列，可与它下游的表达片段形成融合蛋白，但HisTag序列并不影响表达产物的生物学活性，因而不必通过酶水解来获得目的蛋白，使整个表达过程更为简便，同时该序列又可作为蛋白标签用于目的蛋白的检测和纯化。本文通过PCR扩增出可编码204个氨基酸的vIL6基因片段，构建pET32a(+)vIL6原核表达载体，诱导表达融合蛋白，为进一步制备vIL6单克隆抗体提供免疫原并为研究vIL6生物学功能提供重组蛋白奠定基础。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 主要试剂、仪器
　　
　　质粒pGEX6p1vIL6，pET32a（+）及宿主菌E.coli BL21（DE3）均为本室保存［4］。限制性内切酶BamHⅠ，Hind Ⅲ和T4 DNA连接酶均购自晶美生物公司。小剂量琼脂糖凝胶回收试剂盒为Omega公司的产品。pET系统融合蛋白HisTag单克隆抗体购自天根生化科技（北京）有限公司。针对vIL6合成肽（aa195aa204：“PDVTPDVHDK”）的多克隆抗体购自上海百奇生物科技有限公司。蛋白纯化试剂盒Probond Purification System 购自Invitrogen公司。预染蛋白质分子质量标准物为Fermentas公司产品。SCIENTZ JY92IIN 超声波细胞粉碎机由宁波新芝生物科技股份有限公司制造。
　　
　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计与合成

　　根据KSHV vIL6全长基因序列设计一对特异性引物：上游引物5′端引入BamHⅠ限制性酶切位点，下游引物5′端引入Hind Ⅲ限制性酶切位点，由上海申能博彩生物有限公司合成。上游引物序列： 5′TAATGGATCCATGTGCTGGTTCAAGTTGTGGTC 3′(下划线为BamH Ⅰ酶切位点)；下游引物序列： 5′CGGCAAGCTTTTACTTATCGTGGACGTCAGGAG 3′(下划线为Hind Ⅲ酶切位点)。扩增产物预期长度为614 bp。

　　1.2.2 目的基因的PCR扩增

　　以本实验室先前构建的重组质粒pGEX6p1vIL6为模板，用上述引物进行PCR扩增。反应总体积为20 μl，反应体系：10×缓冲液2 μl，10 mmol/L dNTP 0.4 μl，pGEX6p1vIL6模板1 μl，Tagplus 0.2 μl，10 μmol/L上下游引物各0.5 μl，ddh3O 15.4 μl。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸1 min，热循环35次；最后72℃延伸5 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，并按照DNA凝胶电泳回收试剂盒的说明书操作，切胶回收目的基因片段。

　　1.2.3 原核表达载体的构建及鉴定

　　用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ分别双酶切上述PCR产物的胶回收片段和质粒pET32a(+)，37℃水浴过夜，两酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收并纯化，加入T4 DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞。小量提取质粒DNA，经BamH Ⅰ，Hind Ⅲ双酶切及PCR扩增鉴定正确后，送上海英骏公司测序。

　　1.2.4 目的基因在大肠埃希菌中的融合表达

　　分别挑取含重组质粒pET32a(+)vIL6和空载体pET32a(+)的BL21(DE3) 单个克隆，接种LB液体培养基，37℃，225 r/min振荡过夜。取过夜的菌液按1∶50 比例接种至新鲜的LB液体培养基，37℃，225 r/min振荡培养2～3 h。菌液浓度D(600 nm)达0.4～0. 6时，加入IPTG至终浓度为0.8 mmol/ L，继续振荡培养，于4 h后离心收集细菌沉淀用PBS洗涤3次并重悬。取适量的菌液蛋白加入电泳上样缓冲液，100℃煮沸5 min，离心取上清用于SDSPAGE电泳［4］。

　　1.2.5 融合蛋白表达形式的鉴定

　　取10 ml含pET32a(+)vIL6的诱导菌液，8 000 r /min，4℃离心20 min，收集菌体，PBS洗涤后，重悬于1 ml PBS中，冰上超声破碎菌体，12 000 r /min离心10 min，收集上清与沉淀。分别取重组菌未诱导和诱导的全菌液及超声破碎后的上清和沉淀，与蛋白上样缓冲液混匀，100℃煮沸5 min，离心后取上清用于SDSPAGE电泳上样。试验同时设空质粒pET32a(+)未诱导、诱导为对照。采用5%的浓缩胶和12%的分离胶进行SDSPAGE电泳。凝胶经考马斯亮蓝染色，用凝胶成像系统采集图像，分析其表达及可溶性。

　　1.2.6 vIL6融合蛋白的纯化

　　取50 ml表达菌液，8 000 r/min离心5 min收集菌体沉淀。用裂解液重悬上述菌体，室温下震荡5～10 min，使菌体充分裂解。将菌体裂解液置冰上，大功率超声裂解3次，每次5 s。12 000 r/min离心10 min，沉淀菌体碎片，将上清转移至新的离心管中。取上清加入已预处理的亲和层析柱中，按照产品说明书操作。收集洗脱液进行SDSPAGE电泳和蛋白质印迹鉴定。

　　1.2.7 蛋白质印迹法验证融合蛋白的表达

　　采用5%的浓缩胶和12%的分离胶进行SDSPAGE电泳，分别取含空质粒pET32a（+）未诱导和诱导、重组菌未诱导和诱导全菌液、超声破碎后的上清和沉淀、融合蛋白纯化后洗脱液加入电泳上样缓冲液，经煮沸变性后进行蛋白质印迹检测，用增强的化学发光试剂（ECL）检测，X片感光，验证融合蛋白的表达及纯化［4］。

　　2 结果

　　2.1 目的基因PCR扩增
　　
　　以pGEX6p1vIL6质粒为模板进行PCR，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，出现的条带与预期的vIL6全长基因扩增片段大小相符（图1）。

　　2.2 原核表达载体的双酶切鉴定
　　
　　重组质粒pET32a(+) vIL6用BamHⅠ/Hind Ⅲ酶切后，得到两个片段，质粒(5 900 bp)和vIL6基因(615 bp)，见图2。进一步测序证实，所克隆的vIL6基因序列与基因库中已登记vIL6的基因编码区序列完全一致。

　　2.3 融合蛋白的表达及纯化
　　
　　经IPTG诱导后的菌体蛋白进行SDSPAGE电泳分析，结果表明，在相对分子质量为43 000处出现特异性条带，与预期的重组表达融合蛋白大小一致。将诱导菌超声破碎后，取上清和沉淀分别进行SDSPAGE电泳，沉淀部分电泳后可见明显的特异性蛋白表达带；而上清液部分未见特异性蛋白表达带，即表达的重组蛋白以不溶性包涵体形式存在。以Ni2+NTA亲和层析柱纯化融合蛋白，洗脱液用SDSPAGE鉴定，结果显示纯化获得的产物纯度较高（图3）

　　2.4 融合蛋白的鉴定
　　
　　分别用HisTag的单克隆抗体和多克隆抗体（图4）进行蛋白质印迹检测，仅见相对分子质量43 000的产物。

　　图4表明纯化的蛋白不仅可以与His标签抗体作用，同时也可以与vIL6的合成肽抗体发生特异性结合。
　　
　　3 讨论
　　
　　KSHV在细胞核内复制，可建立稳定的潜伏感染。在潜伏期中，KSHV的基因表达受到严格的调控并以附加体的形式存在。机体内外环境的改变可以诱导KSHV进入裂解期。此时KSHV的大部分基因获得表达，并完成病毒基因组的复制，最终包装成具有感染活性的子代病毒颗粒而释放出细胞外，感染其他靶细胞。KSHV感染是卡波济肉瘤发生的必要条件，且作为一新型嗜人B淋巴细胞肿瘤病毒，通过编码多种与人类细胞同源的蛋白干扰正常细胞的增殖与凋亡，引起细胞转化与永生化。另外，KSHV与HIV1可协同感染，导致的艾滋病相关的卡波济肉瘤（AIDSKS）发病率在逐年上升，故目前已被广泛关注［5］。
　　
　　vIL6是ORF K2编码的204个氨基酸组成(23 400)的蛋白，与人IL6（hIL6）有25%的氨基酸序列同源［6］。不同点是vIL6直接与gp130结合，而hIL6先与gp130的gp80亚单位结合，下游信号通路两者均相似［7］。vIL6不仅能阻断IFN介导的细胞周期停滞和细胞凋亡［8］，还能诱导血管形成和血细胞生成［9］。vIL6作为一种多功能细胞因子在体内对很多种细胞具有调节作用，其不仅是骨髓瘤、浆细胞瘤和B细胞的生长因子，能够促进B细胞分化成浆细胞，还涉及许多恶性肿瘤如KS的病理变化过程［10］。另外，在炎症过程中vIL6能抑制细胞凋亡，使细胞能够抵御不利的环境而继续存活，同时进一步使细胞的生长失去正常调控，逐渐向成瘤方向发展。
　　
　　本研究以质粒pET32 a(+)为表达载体，在大肠埃希菌中融合表达vIL6蛋白。融合蛋白仅在诱导后表达，且在D(600 nm)值为0.4～0.6时开始诱导，4 h表达量最高。由于表达的蛋白是以包涵体的形式存在，所以要按照变性蛋白的纯化步骤进行。利用Ni2+NTA 树脂可以方便地将外源蛋白从菌体蛋白中纯化出来。采用HisTag的单克隆抗体和vIL6多克隆抗体对融合蛋白进行蛋白质印迹法分析，鉴定此表达产物为目的蛋白。为避免透析过程中蛋白沉淀，在透析时采取变性剂梯度透析的方式，成功地将融合蛋白透析至水中。本研究成功地获得了融合蛋白HisvIL6，在下一步工作中，将用获得的融合蛋白制备vIL6的多克隆、单克隆抗体。

参考文献

　　［1］Chang Y， Cesarman E， Pessin MS， et al. Identification of herpesviruslike DNA sequences in AIDSassociated Kaposi′s sarcoma［J］. Science，1994，266(5192):1865-1869.

　　［2］Kovaleva M， Bussmeyer I， Rabe B， et al. Abrogation of viral interleukin6(vIL6)induced signaling by intracellular retention and neutralization of vIL6 with an antivIL6 singlechain antibody selected by phage display［J］.J Virol， 2006， 80(17): 8510-8520.

　　［3］Miller G， Heston L， Grogan E. Selective switch between latency and lytic replication of Kaposi′s sarcoma herpesvirus and EpsteinBarr virus in dually infected body cavity lymphoma cells［J］.J Virol，1997，71(1):314-324.

　　［4］徐静，朱晓蕾，秦娣，等.人类疱疹病毒8型ORF50基因截短片段和vIL6全长基因的克隆、表达及表达产物的纯化［J］. 南京医科大学学报:自然科学版，2009，29(3):303-307.

　　［5］Mani D， Neil N， Israel R， et al. A retrospective analysis of AIDSassociated Kaposi′s sarcoma in patients with undetectable HIV viral loads and CD4 counts greater than 300 cells/mm3［J］. J Int Assoc Physicians AIDS Care(Chic Ⅲ)， 2009，8(5):279-285.

　　［6］Neipel F， Albrecht JC， Ensser A，et al. Human herpesvirus 8 encodes a homolog of interleukin6［J］.J Virol，1997，71(1):839-842.

　　［7］Chatterjee M， Osborne J， Bestetti G，et al. Viral IL6 induced cell proliferation and immune evasion of interferon activity［J］. Science， 2002， 298(5597):1432-1435.

　　［8］Aoki Y， Jaffe ES，Chang Y. Angiogenesis and hematopoiesis induced by Kaposi′s sarcomaassociated herpesvirusencoded interleukin6［J］. Blood，1999，93(12):4034-4043.

　　［9］Geraminejad P，Memar O， Aronson I，et al.Kaposi′s sarcoma and other manifestations of human herpesvirus 8［J］. J Am Acad Dermatol， 2002， 47(5): 641-655.

　　［10］Hodge DR， Hurt EM， Farrar WL， et al. The role of IL6 and STAT3 in inflammation and cancer［J］. Eur J Cancer，2005，41(16): 2502-2512.