胶原诱导性关节炎小鼠Th17细胞的检测及意义

　　 作者：史烨 马洁 苏兆亮 杨先知 马斌 田洁 刘艳 刘青玲 邵启祥 许化溪 吕力为 王胜军

【摘要】 目的： 研究Th17细胞及其相关细胞因子白细胞介素17(IL17)在胶原诱导性关节炎(collageninduced arthritis， CIA)小鼠体内的变化。方法： 利用Ⅱ型胶原蛋白建立小鼠CIA模型。应用流式细胞术(FCM)分析小鼠脾脏及引流淋巴结中Th17细胞的比例，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中IL17的含量。结果： CIA小鼠脾脏及引流淋巴结中 Th17细胞的比例分别为(3.19±0.70)%、(3.54±0.97)%，显著高于正常对照组的(0.95±0.34)%、(1.31±0.47)%， P&<0.01。CIA小鼠血清中IL17的含量也明显高于正常对照组(P&<0.05)。结论： Th17细胞及其分泌的细胞因子IL17在CIA小鼠体内明显升高，并与疾病的发生密切相关。

【关键词】 Th17细胞; 白细胞介素17; 胶原诱导性关节炎

　　[Abstract] Objective: To study the expression of Th17 cells and their cytokines (IL17) in the development of collageninduced arthritis (CIA) in mice. Methods: The CIA models were immunized with collagen typeⅡand Freund′s adjuvant. The percentage of Th17 cells in spleens and draining lymph nodes were determined by flowcytometry， and the concentration of IL17 in the serum were examined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) respectively. Results: Compared with the normal group， CIA mice had a significantly higher percentage of Th17 cells in spleens and draining lymph nodes (P&<0.01) and had an increased concentration of IL17 in the serum (P&<0.05). Conclusion: There was a significantly elevated expression of Th17 cells and their cytokines (IL17) in the mice of CIA， which was related to the development of the disease.

　　[Key words] Th17 cells; IL17; collageninduced arthritis

　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎症为特征的慢性自身免疫性疾病。炎症反复发作可导致关节内软骨和骨的破坏，并伴有关节功能障碍。目前的研究表明，T细胞异常免疫应答在RA发生发展中发挥关键作用。Th17细胞是近年发现的一种不同于Th1、Th3细胞的新型CD4+效应性T细胞亚群，主要分泌IL17A/F，IL6，TNF等细胞因子，这些前炎症细胞因子可以促进宿主炎症反应并加剧自身免疫性疾病的发生[1]。小鼠胶原诱导性关节炎(collageninduced arthritis， CIA)是当前研究RA较理想和最为常用的动物模型，它在临床症状和病理表现方面与RA极为相似或相同。本文在建立CIA模型基础上，采用流式细胞术(FCM)检测CIA小鼠脾脏及引流淋巴结中Th17细胞的比例，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CIA小鼠血清中IL17含量，分析Th17细胞及其相关细胞因子与小鼠CIA发病的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 实验动物 SPF级近交系DBA/1小鼠12只，雄性，6～8周龄，购于上海斯莱克实验动物有限公司，随机分为正常对照组和CIA模型组，每组6只。

　　1.1.2 主要试剂 PE标记抗小鼠CD4抗体，FITC标记抗小鼠IL17A抗体及其相匹配的同型对照抗体，Foxp3染色试剂盒，莫能霉素(monensin)，小鼠IL17A的ELISA检测试剂盒均购自eBioscience公司。离子霉素(ionomycin)、乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbol myristic acetate，PMA)购自Sigma公司。Bovine collagen typeⅡ(牛Ⅱ型胶原) 购自Chondrex公司。RPMI1640培养液、小牛血清购自Gibco公司。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 小鼠CIA模型的建立及处理 取等体积CⅡ与弗氏完全佐剂1∶1混合，充分研磨至混合物完全乳化，以乳化物滴入水中不松散为度(冰浴中操作)，取乳化后的CⅡ于小鼠尾根部皮内注射(0.1 ml/只)，并使乳化物吸收完全。于免疫后第21天，利用CⅡ与弗氏不完全佐剂的乳化物加强免疫。从加强免疫后开始，每隔2天对每只小鼠4个足爪进行评分，直至首次免疫第56天为止。具体标准如下[2]：0，关节无红肿;1，关节轻度红肿;2，关节中度红肿;3，关节重度红肿;4，关节畸形。每个足爪最高分为4分，每只小鼠最高分为16分。

　　1.2.2 小鼠脾脏及引流淋巴结中CD4+IL17细胞比例的检测 分离小鼠脾细胞及引流淋巴结细胞，ACK裂解红细胞，淋巴细胞以1×106/ml加入24孔板，同时每孔加入PMA(50 ng/ml)、离子霉素(1 μg/ml)和莫能霉素1 μl，37℃、5%CO2孵育5 h，收集细胞，进行细胞表面CD4分子、胞内IL17因子及相应同型对照抗体染色，利用BD公司FACS Calibur流式细胞仪进行检测。

　　1.2.3 血清中IL17含量的测定 分离小鼠血清，应用IL17A的ELISA检测试剂盒检测血清中IL17(IL17A)含量，严格按照说明书操作，反应终止后用BioTek公司的μQuant酶标仪检测450 nm光密度值，再根据标准曲线确定血清中IL17的含量。

　　1.2.4 统计学分析 利用SPSS12.0软件进行统计分析，各组数据以均数±标准差(x±s)表示，组间采用两样本t检验，以P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各组小鼠Th17细胞比例

　　通过FCM检测CD4+IL17+比例变化，以CD4+T细胞设门，观察到模型组小鼠脾脏及引流淋巴结中Th17细胞比例分别为(3.19±0.70)%，(3.54±0.97)%，较正常对照组[(0.95±0.34)%、(1.31±0.47)%]显著增高(P&<0.01)。见图1。

　　2.2 各组小鼠血清中IL17水平

　　采用ELISA法检测两组小鼠血清中IL17A含量，观察到CIA模型组IL17A含量为(8.93±3.20)pg/ml，显著高于对照组[(3.40±0.83)pg/ml]，两组间比较差异有统计学意义(P&<0.05)。

　　3 讨 论

　　效应性CD4+T细胞活化后，根据其产生的细胞因子和生物学功能的不同，可分为不同的细胞亚群。传统上将其分为Th1、Th3两个细胞亚群。Th1细胞产生IFNγ，通过活化巨噬细胞介导胞内病原微生物的清除和迟发型变态反应;Th3细胞产生IL4、IL5和IL13等细胞因子，介导由嗜酸性粒细胞引起的炎症反应，清除胞外病原微生物并参与变态反应。新近研究发现一类不同于Th1和Th3细胞的CD4+ Th亚群，该亚群细胞主要产生IL17，并且不产生Th1(IFNγ)和Th3(IL4)类细胞因子， 被命名为Th17细胞亚群[1，3]。Th17细胞除分泌IL17外，也能分泌IL1、IL6、TNFα等多种细胞因子，具有强烈的促炎症作用，参与多种自身免疫病的发生和发展[4， 5]。目前越来越多的证据支持以往认为由Th1细胞介导的多种炎症性自身免疫反应，在其中发挥关键作用的是Th17细胞[6]。

　　目前研究认为RA的发生是抗原引发的“激发—链锁反应”过程，感染和自身免疫反应是RA发病和病情迁延过程的中心环节。机体免疫应答水平异常可能在发病过程中起到重要作用，主要涉及效应性T细胞与调节性T细胞，以及各效应T细胞亚群之间比例异常[7]。早期研究认为RA是由Th1细胞介导，然而当动物模型中清除或中和Th1细胞相关因子IFNγ或IL12的功能，并不能预防或减轻CIA疾病的进程，而中和Th17细胞相关因子IL23的功能则延缓了疾病的进程，进而发现了Th17细胞在RA发病过程中的重要作用[8]。Th17细胞可能增强了对Treg细胞的抵抗作用参与RA发病过程，也可能通过分泌多种炎性细胞因子参与发病过程[9，10]。本文在建立小鼠CIA模型的基础上，用流式细胞术及ELISA检测CIA模型小鼠中Th17细胞比例，结果发现CIA模型小鼠的脾脏和引流淋巴结中Th17细胞均明显增加，小鼠血清中IL17水平显著升高，这些实验数据提示Th17在CIA发病过程中具有重要作用，有关Th17细胞在CIA小鼠中增高的机制将是我们下一步研究的目标。

参考文献

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