外源性CO释放分子对肺动脉高压大鼠NO及其合酶的影响

　　　　　　作者：袁菊芳 张赢予 邵东华 孙炳伟

【摘要】 目的： 观察外源性CO释放分子(CORM2)对野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导的肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)大鼠NO及其合酶(NOS)的影响。方法： 成年雄性SD大鼠，一次性腹腔注射MCT 60 mg/kg。第15天经颈内静脉插管测右心室收缩压(sRVP)，筛选出肺高压模型成功大鼠40只。将这40只大鼠随机分为4组：模型组，高剂量组，低剂量组，无活性组，另取10只正常大鼠为正常对照组，共5组。第21天取各组大鼠肺组织测NO、eNOS和iNOS。结果： 与对照组相比，模型组、无活性组NO明显下降 (P&<0.05);与模型组相比，高剂量组、低剂量组NO明显升高(P&<0.01)。与对照组相比，模型组、无活性组、低剂量组eNOS明显下降，iNOS明显升高(P&<0.05);与模型组相比，高剂量组、低剂量组eNOS升高，iNOS下降(P&<0.01)。结论： CORM2对PAH的治疗作用可能是通过调节eNOS、iNOS的活性进而影响NO的产生与释放来完成。

【关键词】 CO释放分子; 肺动脉高压; 氧化亚氮; 氧化亚氮合酶

　　[Abstract] Objective: To investigate effects of COreleasing molecules [tricarbonyldichlororuthenium (Ⅱ) dimer， CORM2]liberated CO on nitric oxide (NO) and nitric oxide syntheses (eNOS/iNOS) in monocrotaline (MCT)induced pulmonary artery hypertension( PAH ) in rats. Methods: MCT solution was given as a single subcutaneous injection (60mg/kg) to male Sprague Dawley rats. At the end of fifteen day， right ventricular systolic pressures (sRVP) were measured through the left jugular vein. Forty SD rats with PAH were randomly pided into 4 groups: PAH (model group)， the others received continuous administration of CORM2 [4 mg/(kg·d)， highdose group]， CORM2 [2 mg/(kg·d)，lowdose group]， or inactive CORM2 (inactive group) separately. In parallel 10 SD rats were taken as control group (control group). On the twentyfirst day， NO and NOS of lung tissue sections were measured by biochemical methods. Results: The NO was decreased in model and inactive groups compared with control group; while there was an increase in highdose and lowdose groups in the lung tissue compared with model group.Compared with control group， the eNOS was decreased but the iNOS was increased significantly in model，inactive and lowdose groups. This was accompanied by a decrease in the expression of iNOS while an increase in the expression of eNOS in the lung tissue of highdose and lowdose groups compared with model group. Conclusion: Regulating the expression of eNOS and iNOS and influencing NO production were the possible mechanism of protecting effect of CORMreleased CO modulates on PAH.

　　[Key words] COreleasing molecules2; pulmonary arterial hypertension; nitric oxide; nitric oxide syntheses

　　肺动脉高压(pulmonary artery hypertension，PAH)是许多不同疾病发展的共同结果，以肺血管阻力不断增高、血管增生纤维化、重建、体循环淤滞及右心衰为特征[1]。通过对气体分子NO和CO机制的研究后将其用于PAH的临床治疗，明显降低了PAH的死亡率，使得PAH的治疗有了极大进展[2-4]。NO和CO直接抑制血小板的聚集和血管平滑肌细胞的增生，维持着肺血管的稳态，是舒张肺动脉最为有用的分子，与PAH的形成密切相关。NO是由NO家族酶系氧化亚氮合酶(NOS)作用后所产生，内皮细胞氧化亚氮合成酶(eNOS)受许多血管舒张因子和生理刺激因素调节，包括缺氧，感染和氧化物抑制等。已经证实PAH患者肺血管的eNOS水平减少，表现为肺血管收缩[5-6]。相应的，eNOS-/-的大鼠模型易发展成PAH[7-8]。外源性CO释放分子(COreleasing molecules2，CORM2)是CO释放因子，是特殊的CO携带者，在合适的环境下释放一定量可测量的、可控的有效CO进入生物学系统。我们前面的研究证实CORM2释放的CO对肺动脉高压有治疗作用[9]，但其机制还有待于进一步研究。本研究旨在观察CORM2对野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导的PAH大鼠肺组织NO及NOS的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 肺动脉高压模型的建立

　　健康成年雄性SD大鼠60只，体质量(250±20)g，由江苏大学实验动物中心提供。随机分为正常对照组(10只)和造模组(50只)，造模组用0.1%盐酸完全溶解野百合碱，0.1%氢氧化钠滴定pH至7.0，腹直线旁一次性腹腔注射野百合碱溶液60 mg/kg，建立PAH模型。

　　1.2 模型的评价方法

　　将造模组50只大鼠用氯胺酮(100 mg/kg)腹腔注射行全身麻醉，然后切开右颈部皮肤，游离出胸锁乳突肌下的颈内静脉，经颈内静脉插入颈内静脉导管(德国柏林心脏中心提供)，通过换能器连接Dash4000监护仪，慢慢送入导管同时观察波形的变化，进入右心室时测出右心室收缩压(sRVP)，筛选出sRVP明显增高的肺高压成功模型大鼠40只。

　　1.3 动物分组和给药

　　野百合碱造模成功40只大鼠，随机分为4组：模型组，高剂量组，低剂量组和无活性组。用DSMO溶解CORM2，再以生理氯化钠溶液稀释成40 mmol/L溶液[10]，高剂量组和低剂量组分别经大鼠股静脉缓慢注入CORM2 4 mg/kg和2 mg/kg，我们先前的研究已证实，大鼠注入4 mg/kg的CORM2时碳氧血红蛋白(COHb)&<10%，在安全范围内[9]。注毕，给予大鼠吸氧5～10 min，待其活动明显好转后分笼饲养;无活性组所用的CORM2溶液放置24 h并用NO冲去残留的CO[11]，再将此CORM2溶液经大鼠股静脉缓慢注入;模型组和正常对照组均经大鼠股静脉注入生理氯化钠注射液。

　　1.4 NO、NOS的测定

　　取大鼠肺组织称重后置于超声匀浆仪中，用生理盐水制备组织匀浆，离心取肺匀浆上清液，严格按试剂盒说明书 (试剂盒购自南京建成生物工程有限公司)测定NO、NOS。

　　1.5 统计学分析

　　所有资料采用SPSS11.0软件处理，计量资料以(x±s)表示，组间比较用SNK法检验，多组比较用方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　正常对照组大鼠全部存活，造模组大鼠普遍出现活动减少，食量减少，体质量下降，第15天死亡率约20%。

　　与对照组相比， 模型组、无活性组NO明显下降 (P&<0.05)，低剂量组、高剂量组NO与对照组比较，差异无统计学意义(P&>0.05);与模型组相比，高剂量组、低剂量组NO明显升高(P&<0.01);无活性组与模型组比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。

　　与对照组相比， 模型组、无活性组、低剂量组eNOS明显下降、iNOS明显升高(P&<0.05)，高剂量组eNOS、iNOS与对照组相比较，差异无统计学意义(P&>0.05);与模型组相比，高剂量组、低剂量组eNOS明显升高、iNOS明显下降(P&<0.01);无活性组与模型组比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。表1 各组大鼠肺组织NO及NOS检测结果

　　3 讨 论

　　目前，国内外有多种关于建立肺高压动物模型的方法，比较成熟的是慢性缺氧、空气栓塞、药物诱导以及手术建立左向右分流动物模型等，其中野百合碱(MCT)诱导的肺高压是一种比较经典的药物诱导性肺高压模型[12]。

　　MCT是双吡咯类生物碱，在肝脏内经P450 单氧化酶转化后，经由血液循环到达肺脏，可引起肺动脉血管不可逆性的损伤。肺动脉血管内皮细胞被认为是MCT的靶细胞，内皮细胞损伤在肺动脉血管重建过程中起着关键作用，MCT注射可以选择性地损伤肺循环血管内皮细胞，继而引起一系列肺血管病理改变如内弹力层断裂、弹性蛋白和胶原蛋白等细胞外基质合成、沉积增加，形成类似血管闭塞性的病理改变，引起血管顺应性下降、阻力增加，并诱导肺动脉血管壁的重建，特别是平滑肌明显增生，右心室肥厚，最终导致肺动脉压力升高 [13-14]。

　　CORM2 作为一种新型的CO 释放剂，能溶于DMSO 释放出CO。DMSO是一种万能溶媒，也是一种羟自由剂清除剂，有抗氧化损伤作用，但是当其质量浓度低于0.1%时，对损伤并无影响[15] 。本研究用的DMSO浓度为0.025%，所以认为DMSO在研究过程中的效用可忽略。

　　血红素加氧酶1(HO1)是分解血红素变成CO、胆绿素、游离铁的限速酶。许多细胞不断地表达HO2，而HO1只有在感染和氧化时才表达。缺少在肺血管产生CO的HO1的大鼠不能耐受缺氧最终导致右心衰。CO和硫化氢(h3S)是内源性产生的血管舒张气体，它们的缺少能引起PAH[16]。CO能舒张血管和抑制血管增生，对维持血管系统内稳态起着重要作用。而肺动脉高压正是一类以异常的平滑肌细胞增生和重建形成肺血管为特征的疾病，经研究证明HO/CO系统在肺动脉高压形成过程中起着重要的作用[17-18]。内皮细胞HO/CO系统与NO系统相互作用，当NO的生成及功能受到影响时 ，CO在调节高血压方面起着重要的作用[19]。Zuckerbraun等[20]报道CO逆转PAH的作用依赖于NO的产生，由此提出可应用CO来治疗临床PAH。

　　在预实验时我们依据文献[10]，从大鼠股静脉缓慢注入CORM2 8 mg/kg后，肺高压大鼠死亡较多，可能是中毒而死，病理检查发现肺组织内有大量中性粒细胞浸润，故我们选择CORM2 4 mg/kg和2 mg/kg两个剂量。我们的实验证实大鼠注入4 mg/kg的CORM2时COHb&<10%，在安全范围内。

　　NO化学性质活泼，在体内代谢时很快转化为NO-2 / NO-3，而NO-2又进一步转化为NO-3。本法利用硝酸还原酶的特异性将NO-3还原为NO-2，通过显色深浅测定其浓度的高低。NOS催化LArg和分子氧反应生成NO，NO与亲核性物质生成有色化合物，在530 nm 波长下测定光密度，根据光密度大小可计算出NOS活性。NOS主要有两种类型：结构型(cNOS) 和诱导型(iNOS)。 cNOS包括内皮细胞型(eNOS)、神经细胞型(nNOS)，而在肺组织内皮细胞是eNOS;iNOS 不依赖于钙，依此原理可进行分型测定：测定总NOS(tNOS )，加入钙离子抑制剂测定iNOS，cNOS=tNOS-iNOS。

　　本实验发现，与对照组相比，野百合碱能使大鼠肺组织内的NO、eNOS明显下降 (P&<0.05)，iNOS明显增高;而静脉注入CORM2的模型鼠NO变化不明显。高剂量组eNOS、iNOS与对照组相比较，差异无统计学意义(P&>0.05);与模型组相比，高剂量组、低剂量组eNOS升高，而iNOS下降(P&<0.01);无活性组与模型组相比无统计学意义(P&>0.05)。这些数据说明CORM2释放的CO可调节NO的生成。

　　越来越多的研究和实验揭示，NOS/NO系统与HO/CO系统之间具有复杂的交互作用，两者作为气体信号调节网络在低氧性肺血管结构重建和PAH 的形成中发挥重要调节作用。低氧性PAH 形成过程中NO体系能够诱导常氧及低氧肺动脉平滑肌细胞HO1 mRNA的表达，使肺动脉HO/CO体系上调，且NO对肺动脉HO/CO体系的促进作用可能参与CO对低氧性肺血管结构重建和PAH 的调节[21]。内源性CO对NOS/NO体系的调节机制尚不明了。我们先前的研究结果已表明，4 mg/kg CORM2对肺动脉高压治疗效果较好，2 mg/kg有一定的治疗效果[9]。结合本实验结果，CORM2治疗的机制可能是：① 外源性CO可诱导细胞释放NO，从而增加组织及血中NO 的含量。② 外源性CO可能通过诱导eNOS基因转录和表达水平的提高，进而使组织及血中eNOS 活性增加，促进NO的生成。外源性CO对NOS/NO体系的调节作用是其治疗的可能机制之一，CORM2与其他因子的相互作用及治疗机制尚需进一步研究。

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